楊學(xué)麗 路三軍 魏娉 安欣 尹峰 孫健

·論著·

DKK-1和β-catenin在近端胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義

楊學(xué)麗 路三軍 魏娉 安欣 尹峰 孫健

目的探討DKK-1(Dickkopf-1)和β-catenin 在近端胃腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測61 例近端胃腺癌組織中DKK-1 和β-catenin 表達(dá)情況，并結(jié)合近端胃腺癌的臨床病理特征進行分析。結(jié)果在61 例近端胃腺癌組織中，DKK-1 陽性表達(dá)率和β-catenin 異常表達(dá)率分別為34.4%(21/61)和68.9%(42/61)。DKK-1的表達(dá)在腫瘤的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；β-catenin的表達(dá)在腫瘤的分化程度方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在近端胃腺癌中DKK-1 和β-catenin 的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。結(jié)論DKK-1 的表達(dá)上調(diào)可能在近端胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用并可提示預(yù)后及轉(zhuǎn)移，它與β-catenin可能存在調(diào)節(jié)及負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

DKK-1；β-catenin；近端胃腺癌；分化；轉(zhuǎn)移

近端胃腺癌是指腫瘤位于近端胃組織，且完全位于在食管胃交界下方。目前認(rèn)為它來源于胃，但是它又與其他部位的胃癌不同，在流行病學(xué)背景、解剖學(xué)組織學(xué)特性、臨床表現(xiàn)及分子概況等方面不同于遠(yuǎn)端胃癌[1]。DKK-1是一種分泌型蛋白，作為Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控因子而被廣泛關(guān)注。最早發(fā)現(xiàn)于非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞內(nèi)，在誘導(dǎo)胚胎頭部發(fā)育的過程中期重要作用。目前研究表明DKK-1在多種腫瘤中表達(dá)異常[2-5]。 β-catenin 作為Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。β-catenin在細(xì)胞中起不同的作用:(1)組成細(xì)胞粘附/肌動蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)成分;(2)游離型β-catenin作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在基因轉(zhuǎn)錄中起作用。此外，β-catenin介導(dǎo)細(xì)胞增生或抗凋亡基因的表達(dá)。本研究采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測近端胃腺癌中DKK-1 和β-catenin蛋白的表達(dá)并分析其臨床意義，明確近端胃腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 61例近端胃腺癌石蠟組織標(biāo)本取自2011年5月至2012年6月我院病理科，患者術(shù)前均無放化療史；其中男45例，女16例；年齡42～80歲；平均年齡63.7歲；肉眼觀察腫瘤主體位于胃上部，且未侵及食管；腫瘤侵及淺肌層9例，侵及深肌層32例，侵及漿膜層20例；其中高分化癌12 例，中分化癌34 例，低分化癌15 例；其中Ⅰ/Ⅱ期28 例，Ⅲ/Ⅳ期33 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例。臨床病理分期以術(shù)后病理為依據(jù)，按照美國癌癥聯(lián)合會(AJCC) 制定的TNM分期方案；組織學(xué)分類采用世界衛(wèi)生組織發(fā)表的“國際腫瘤組織分類”。

1.2 主要試劑 兔抗人DKK-1 多克隆抗體購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗體、SP 免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB 顯色劑均購自邁新生物技術(shù)公司。

1.3 方法 將制備好的石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)抗原，3%過氧化氫溶液以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉，分別滴加一抗為兔抗人DKK-1 多克隆抗體(1∶50)和兔抗人β-catenin 多克隆抗體(1∶100)，37℃孵育2～3 h后依次滴加山羊抗兔二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固。以上試驗以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒。每張切片隨機選取5 個高倍視野，每個視野計數(shù)200 個癌細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比。DKK-1 陽性表達(dá)定位于胞漿，偶有細(xì)胞核表達(dá)，根據(jù)染色程度評分，無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細(xì)胞百分比，<10%為0分，10%～25%為1 分，26%～50%為2 分，>50%為3 分；將細(xì)胞染色程度計分與陽性百分?jǐn)?shù)計分相加即為綜合評分，積分為0～2分，表示陰性(-)；3～4 分為陽性(+)；5～6分為強陽性(++)；后兩者均視為陽性表達(dá)。β-catenin按照J(rèn)awhari等的方法，染色分級標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞膜表達(dá)減少或基本消失為0分；胞漿或細(xì)胞核表達(dá)為1分；異質(zhì)性表達(dá)減弱為2分；保留細(xì)胞膜的表達(dá)為3分。0～2分為異常表達(dá)，3分為正常表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗及Fisher檢驗，作spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DKK-1 的表達(dá)與近端胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系 DKK-1 在近端胃腺癌中的陽性表達(dá)率為34.4%(21/61)。DKK-1 在不同性別、年齡的近端胃腺癌組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在高分化、中分化、低分化組中的表達(dá)率分別為8.3%、35.3%、60.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在Ⅰ/Ⅱ期及Ⅲ/Ⅳ期肺癌中的表達(dá)率分別為35.7%、63.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的表達(dá)率分別為69.4%、36.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2，表1。

2.2 β-catenin 的表達(dá)與近端胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系 β-catenin在近端胃腺癌中的異常表達(dá)率68.9%(42/61)。β-catenin的異常表達(dá)與患者的性別、年齡無關(guān)，而且在近端胃腺癌的腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在高分化、中分化、低分化組中的異常表達(dá)率分別為33.3%、73.5%、86.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4，表1。

圖1 DKK?1(免疫組化×100)

圖2 DKK?1(免疫組化×400)

圖3 β?catenin(免疫組化×100)

圖4 β?catenin(免疫組化×400)

2.3 DKK-1 與β-catenin在近端胃腺癌中的相關(guān)性 對2 個指標(biāo)作關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)在近端胃腺癌組織中DKK-1與β-catenin的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。見表1。

表1 DKK-1與β-catenin在近端骨腺癌中的相關(guān)性 例(%)

3 討論

近端胃腺癌因解剖位置的特殊性，過去被稱為胃“賁門”癌，新版WHO把其歸類于食管胃交界腺癌。腫瘤完全位于食管胃交界下方，未侵及食管。有研究表明近端胃腺癌與遠(yuǎn)端胃腺癌不同，它與幽門螺桿菌呈負(fù)相關(guān)[6]。幽門螺桿菌誘導(dǎo)性胃炎所致的胃酸下降可阻止近端胃腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)化。

Wnt通路是一條介導(dǎo)細(xì)胞生長的信號通路,在正常胚胎細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。β-catenin位于3q21，是一種多功能的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。它在細(xì)胞內(nèi)分布的改變可反映其功能變化，作為Wnt信號傳導(dǎo)途徑的重要陽性調(diào)節(jié)因子，其在胞漿/核中的表達(dá)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和浸潤密切相關(guān)。作為Wnt 信號途徑的負(fù)調(diào)控因子，DKK-1 通過與輔助受體LRP6發(fā)生相互作用，進而抑制Wnt途徑[7]。消化道腫瘤中，DKK-1在食管癌中的表達(dá)是上調(diào)的[5]。但是有研究認(rèn)為胃癌組織中DKK1的表達(dá)下調(diào)[8]。其在消化道腫瘤中差異性表達(dá)的意義尚不完全清楚。

本研究采用免疫組織化學(xué)SP的方法檢測61 例近端胃腺癌中DKK-1 的表達(dá)，其表達(dá)率為34.4%，大部分在胞漿中表達(dá)，偶有細(xì)胞核中表達(dá)。結(jié)果顯示隨著近端胃腺癌的分化程度降低，DKK-1 的表達(dá)也隨之升高；臨床分期越晚，DKK-1 的表達(dá)也明顯升高；結(jié)果顯示DKK-1與腫瘤的分化程度及分期密切相關(guān)；而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于陰性組者，提示DKK1的過表達(dá)能夠增加細(xì)胞的侵襲能力。本研究的結(jié)果與Kuang等[9，10]的研究結(jié)果相吻合。

本研究顯示β-catenin 在近端胃腺癌中的異常表達(dá)率68.9%。在高分化、中分化、低分化組中的異常表達(dá)率分別為33.3%、71.5%、86.7%，低分化癌細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失，并出現(xiàn)胞漿、細(xì)胞核的表達(dá)，這與Cheng等[11，12]研究結(jié)果一致。提示β-catenin的異常表達(dá)可能會影響腫瘤的分化程度。β-catenin 降解過程的任何異常都有可能導(dǎo)致其異常表達(dá)和聚集。而且有人發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的GC 細(xì)胞中不表達(dá)β-catenin,并且認(rèn)為正是由于缺失β-catenin,故無法與E-cahherin 形成復(fù)合體,導(dǎo)致細(xì)胞黏附功能降低或喪失,使腫瘤細(xì)胞易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

總之，DKK-1 在近端胃腺癌中呈高表達(dá)，其表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。我們推測高表達(dá)的DKK-1 可能與Wnt 信號失控或負(fù)反饋機制有關(guān)。有關(guān)DKK-1與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的關(guān)系已有相關(guān)的報道[13，14],具體的作用機制有待進一步深入的研究。研究表明DKK-1能夠提高食管癌細(xì)胞的侵襲能力,在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中具有促進作用[15]；本研究從蛋白水平進一步支持了近端胃腺癌在組織發(fā)生、發(fā)展機制上更接近于食管癌，不同于遠(yuǎn)端胃癌。DKK-1在低分化癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)上調(diào)，提示其可作為評判腫瘤分化程度及檢測預(yù)后的指標(biāo)。DKK-1與Wnt/β-catenin的具體調(diào)控機制,需要我們擴大樣本量，并在分子水平上進一步進行深入探討。

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ExpressionandclinicalsignificanceofDKK-1andβ-catenininproximalgastriccancer

YANGXueli,LUSanjun,WEIPing,etal.

DepartmentofPathology,TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056002,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of dickkopf-1(DKK-1) and β-catenin in proximal gastric cancer.MethodsThe expression of DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer was detected by immunohistochemistry (SP) in 61 cases of proximal gastric cancer,and the detection results combined with clinical pathological characteristics of proximal gastric cancer were statistically analyzed.ResultsThe positive expression rate of DKK-1 and the abnormal expression rate of β-catenin in proximal gastric cancer tissue were 34.4%(21/61)and 68.9%(42/61),respectively.The expression of DKK-1 was closely correlated to the degree of tumor differentiation,clinical staging and lymph node metastasis(P<0.05).The expression of β-catenin was significantly associated with the degree of tumor differentiation(P<0.05).The expression of DKK-1 was closely correlated with that of β-catenin in proximal gastric cancer (P<0.05).ConclusionThe overexpression of DKK-1 may play an important role in the pathogenesis and development of proximal gastric cancer,which can indicate prognosis and metastasis of tumor.The relation between DKK-1 and β-catenin may be regulation each other and negative feedback regulation.

dickkopf-1；β-catenin；proximal gastric adenocarcinoma；differentiation;metastasis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.004

056002 河北省邯鄲市第一醫(yī)院病理科

路三軍， 056002 河北省邯鄲市第一醫(yī)院病理科；

E-mail：lusanjun211@163.com

R 735.2

A

1002-7386(2014)21-3214-03

2014-05-11)