呂鐵偉，孫慧超，張 蕾，劉玲娟，吳曉云，劉曉燕，朱 靜，劉振國(guó)，田 杰△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400014；2.兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014；3.美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，哥倫布 43210）

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室純化的單一干細(xì)胞株，已經(jīng)被證明能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為具有內(nèi)皮功能的成熟內(nèi)皮細(xì)胞［1］，其可以作為以內(nèi)皮受損或功能失調(diào)為基礎(chǔ)病理改變的動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的根治種子細(xì)胞。而氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，Oct－4（octamer binding transcription factor－4）是高表達(dá)于干細(xì)胞的八聚體轉(zhuǎn)錄因子，能夠維持干細(xì)胞自我更新的能力，而在干細(xì)胞定向分化的過(guò)程中表達(dá)逐漸減弱甚至消失，是當(dāng)前公認(rèn)的干細(xì)胞表面標(biāo)記之一。本文以MSCs為研究對(duì)象，擬在MSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中加入ox－LDL進(jìn)行干預(yù)，明確其對(duì)MSCs增殖能力和Oct－4表達(dá)情況的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 MSCs為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心劉振國(guó)實(shí)驗(yàn)室分離和提純的細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)體系包括低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco）、MCDB、ITS、LA－BSA、L－ascorbic acid、EGF（均購(gòu)自Sigma）、PDGF（R＆D Systems）、β－Mercaptoethanol（Fisher公司）、LIF（Esgro公司）和青／鏈霉素（Cellgro公司），ox－LDL及天然低密度脂蛋白（native low density lipoprotein，nLDL）為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Sam′s實(shí)驗(yàn)惠贈(zèng)，蛋白免疫印跡法（West blot）檢測(cè) Oct－4、Bcl－2相關(guān)試劑及抗氧化劑乙酰半胱氨酸（N－acetylcycteine，NAC）購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 MSCs培養(yǎng)傳代 本研究將MSCs以100～200／cm2的密度接種于玻璃培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2和5%O2的孵箱中培養(yǎng)，一般2～3h細(xì)胞即貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24～48h后在細(xì)胞相互接觸之前，采用胰酶消化傳代細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入胰酶1mL消化細(xì)胞，收集細(xì)胞于10mL試管中，4℃1500r／min離心，培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以低密度（100～200／cm2）接種于新的培養(yǎng)皿放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2 ox－LDL影響細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) MSCs被分為4組：ox－LDL組，在培養(yǎng)基中加入不同濃度（1、5、10、20μg／mL）的ox－LDL；ox－LDL＋NAC組，采用抗氧化劑 NAC預(yù)處理后再在培養(yǎng)基中加入ox－LDL；陰性對(duì)照組，在培養(yǎng)基中加入相對(duì)應(yīng)濃度的nLDL；對(duì)照組，MSCs放在正常培養(yǎng)不加其他任何干預(yù)因素；ox－LDL組分別在培養(yǎng)基加入終濃度分別為1、5、10、20μg／mL的ox－LDL；nLDL組則加入與ox－LDL相對(duì)應(yīng)濃度的nLDL；在細(xì)胞培養(yǎng)的第12、24和48小時(shí)收集3組細(xì)胞，計(jì)數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線，每實(shí)驗(yàn)組要求的樣本量分別為3個(gè)。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2及Oct－4的表達(dá) 采用蛋白提取試劑盒提取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，按照蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)Bcl－2和Oct－4的表達(dá)，首先進(jìn)行變性十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），放入電轉(zhuǎn)系統(tǒng)恒流轉(zhuǎn)膜2h后，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，封閉結(jié)束后加入相對(duì)應(yīng)的一抗于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的與一抗相對(duì)應(yīng)的種屬特異性二抗）室溫震蕩孵育1h，TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光劑室溫孵育3min，暗室中進(jìn)行定影顯影，采用凝膠圖形分析軟件對(duì)特異性條帶進(jìn)行灰度掃描和定量分析，蛋白的灰度值用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行校正。

1.2.4 氧化活性產(chǎn)物（ROS）檢測(cè) 采用電子順磁震蕩（EPR）技術(shù)檢測(cè)各組培養(yǎng)基中ROS的含量。首先收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度達(dá)到107／mL，每個(gè)樣本中抽取100μL細(xì)胞懸液加入EPR微小玻璃吸管中，再置于EPR儀器進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)定，描繪各組的EPR信號(hào)，統(tǒng)計(jì)EPR信號(hào)強(qiáng)度并進(jìn)行對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，曲線及直方圖采用Sigmaplot軟件繪制，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)階段的形態(tài) 將 MSCs以低密度（100～200／cm2）接種培養(yǎng)在氧含量為5%的CO2孵箱中，大約2～3h后細(xì)胞全部貼壁，貼壁細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈梭形、圓形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積大，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞間互不接觸，培養(yǎng)48h后細(xì)胞增殖明顯增加，幾乎鋪滿培養(yǎng)皿底部，細(xì)胞間形成接觸。

2.2 ox－LDL影響MSCs增殖能力的檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)皿底部面積約為53cm2，每個(gè)培養(yǎng)皿總接種細(xì)胞數(shù)約為（1～2）×104，加6mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后細(xì)胞數(shù)量約擴(kuò)增為4×105個(gè)，大約擴(kuò)增20倍，傳代后細(xì)胞仍保持同樣的擴(kuò)增能力。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示ox－LDL對(duì) MSCs增殖的抑制作用與培養(yǎng)時(shí)間和干預(yù)濃度呈正相關(guān)：與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，濃度為1μg／mL的ox－LDL使 MSCs增殖速度稍有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而濃度為5μg／mL和10μg／mL時(shí)則導(dǎo)致 MSCs的增殖速度明顯減弱（5μg／mL時(shí)P＜0.05，10 μg／mL 時(shí) P ＜0.01），其 中，10μg／mL 及20μg／mL在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量增加極少，到48h細(xì)胞增加的量不到初始接種濃度的1倍，見(jiàn)圖1，而nLDL組細(xì)胞增殖未受影響（結(jié)果未顯示），NAC預(yù)處理后提高了 MSCs的數(shù)量，但在ox－LDL濃度為10、20μg／mL時(shí)提升效率不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在5μg／mL時(shí)，NAC預(yù)處理后大大增加了MSCs的數(shù)量（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 不同濃度ox－LDL引起細(xì)胞凋亡及對(duì)Bcl－2表達(dá)水平的影響 在MSCs體外培養(yǎng)過(guò)程中，與原代培養(yǎng)的細(xì)胞相比，高濃度的ox－LDL明顯抑制MSCs的增殖，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞已破碎且失去了細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3；采用Western blot觀察ox－LDL干預(yù)后不同實(shí)驗(yàn)組Bcl－2表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，用10μg／mL及以上濃度的ox－LDL進(jìn)行干預(yù)后的細(xì)胞抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl－2幾乎沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)，NAC預(yù)處理后則出現(xiàn)Bcl－2的表達(dá)，但表達(dá)量與對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，具體數(shù)據(jù)未顯示），見(jiàn)圖4。

圖1 各濃度ox－LDL對(duì)MSCs增殖的影響

圖2 抗氧化劑NAC對(duì)ox－LDL處理后MSCs增殖的逆轉(zhuǎn)作用

圖3 原代培養(yǎng)傳代前（左）和ox－LDL干預(yù)后（右）細(xì)胞形態(tài)的改變（×100）

2.4 ox－LDL對(duì)干細(xì)胞表面標(biāo)記Oct－4表達(dá)水平的影響 本實(shí)驗(yàn)采用 Western blot觀察ox－LDL對(duì)Oct－4表達(dá)水平的影響，在細(xì)胞體外培養(yǎng)24h，分別提取濃度為5μg／mL的ox－LDL組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μg／mL ox－LDL組Oct－4的表達(dá)明顯減弱，表達(dá)相對(duì)量?jī)H為對(duì)照組的14%左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，具體數(shù)據(jù)未顯示），見(jiàn)圖5，10μg／mL及以上濃度的ox－LDL干預(yù)后Oct－4的表達(dá)更減弱，僅有極微量的表達(dá)（結(jié)果沒(méi)有顯示），而NAC預(yù)處理后Oct－4的表達(dá)量恢復(fù)接近正常，約為79%。而nLDL組Oct－4的表達(dá)卻沒(méi)有受到明顯影響。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組Bcl－2的表達(dá)

2.5 NAC阻止ox－LDL來(lái)源的ROS的產(chǎn)生 EPR技術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)體系中ROS的形成情況，結(jié)果顯示對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)EPR信號(hào)，5μg／mL ox－LDL組則出現(xiàn)典型的EPR信號(hào)，而ox－LDL＋NAC組中則沒(méi)有檢測(cè)到EPR信號(hào)（圖6）；ROS的產(chǎn)生具有時(shí)間依賴性，當(dāng)ox－LDL干預(yù)MSCs時(shí)培養(yǎng)體系中即刻就出現(xiàn)EPR信號(hào)，信號(hào)表達(dá)的強(qiáng)度在ox－LDL干預(yù)后60s達(dá)到最高峰，以后穩(wěn)定在高水平狀態(tài)（圖6B）；同樣ROS的產(chǎn)生是劑量依賴型的，正常培養(yǎng)的細(xì)胞體系幾乎檢測(cè)不到EPR信號(hào)，而加入ox－LDL干預(yù)后的細(xì)胞體系EPR信號(hào)強(qiáng)度明顯增加，且隨著ox－LDL干預(yù)濃度的增加，EPR信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)增加，但是培養(yǎng)體系經(jīng)抗氧化劑NAC預(yù)處理5min后，即便再加入ox－LDL干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)體系中EPR信號(hào)強(qiáng)度則明顯減弱接近正常細(xì)胞水平（圖6C），而nLDL組則沒(méi)有類似現(xiàn)象，說(shuō)明培養(yǎng)體系中ROS的產(chǎn)生來(lái)源于ox－LDL，且ROS產(chǎn)生量與ox－LDL的濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)，但抗氧化劑NAC預(yù)處理后可以完全阻止ox－LDL來(lái)源的ROS的產(chǎn)生。

圖5 不同組別Oct－4的表達(dá)情況

圖6 不同組別活性氧產(chǎn)物ROS形成的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新和多向分化的特點(diǎn)，其存在于骨髓基質(zhì)中，含量極低（0.1‰），但在體外擴(kuò)增容易，適宜條件下自身數(shù)量能夠迅速增加，另外骨髓基質(zhì)是低氧環(huán)境（小于7%），該環(huán)境能夠維持細(xì)胞的無(wú)限增殖和自我更新的能力，體外低氧條件下培養(yǎng)能最大限度發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)特性［2－3］。而體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混雜有少量如成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞群體，這種混雜細(xì)胞群體會(huì)影響研究的準(zhǔn)確性和單一性，因此，本實(shí)驗(yàn)所采用的MSCs為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室分離和提純的細(xì)胞株，被認(rèn)為是單一的干細(xì)胞株，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群陽(yáng)性表達(dá)Oct－4，Rex－1，c－Kit和 Pdgfr－α，而細(xì)胞表面標(biāo)記 Sca－1，CD34，CD45，Sox－2和 Nanog的表達(dá)卻為陰性［3］；Oct－4屬 POU 家族蛋白，是一類在動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，能夠維持干細(xì)胞的全能性及未分化狀態(tài)［4］。Oct－4蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征為具有POU家族特有的保守結(jié)構(gòu)域（POUs）和POU同源異型結(jié)構(gòu)域（POUHD），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可與DNA上特定區(qū)域形成雙向結(jié)合，進(jìn)而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控［5］。本實(shí)驗(yàn)顯示 MSCs高表達(dá)Oct－4，當(dāng) MSCs受到ox－LDL干預(yù)時(shí)Oct－4的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞的增殖能力顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)Oct－4是維持干細(xì)胞的全能性及未分化狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。

內(nèi)皮遍及整個(gè)心血管系統(tǒng)，主管血液運(yùn)輸、物質(zhì)交換和血管活性物質(zhì)的分泌等功能，內(nèi)皮的受損或功能失調(diào)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管事件的發(fā)生和發(fā)展［6］，故內(nèi)皮正常功能的重建或內(nèi)皮再生是嚴(yán)重心血管事件未來(lái)治療的主攻方向。內(nèi)皮再生來(lái)源于循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），內(nèi)皮細(xì)胞受損或者破壞導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，可觸發(fā)循環(huán)EPCs的成熟過(guò)程，最后EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)彌補(bǔ)其數(shù)量的不足從而維持心血管內(nèi)皮系統(tǒng)的正常功能，而EPCs來(lái)源于骨髓，其數(shù)量和功能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)；臨床上內(nèi)皮受損或功能失調(diào)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的發(fā)生，研究證實(shí)這些心血管疾病個(gè)體體內(nèi)EPCs的數(shù)量明顯減少［6－8］，因此，推測(cè)可能是某些因素導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化受到抑制，繼而內(nèi)皮細(xì)胞的生成數(shù)量降低，從而促進(jìn)嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生，因此，該過(guò)程中相關(guān)機(jī)制的闡明具有重大的臨床和社會(huì)意義，也是本研究實(shí)施的原始推動(dòng)力。

多種因素可以引起內(nèi)皮受損或功能失調(diào)，脂代謝紊亂是一大誘因，高脂血癥導(dǎo)致內(nèi)膜受損，脂點(diǎn)脂紋形成，繼而出現(xiàn)纖維斑塊和粥樣斑塊。最后導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的形成，而ox－LDL和氧化應(yīng)激是這一過(guò)程的物質(zhì)和病理生理基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制尚不清楚。ox－LDL對(duì)靶細(xì)胞的作用因細(xì)胞類型不同而不同，并且這種作用機(jī)制復(fù)雜而多變，ox－LDL能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞的凋亡，但另一方面ox－LDL在抑制內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)EPCs的增殖進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的凋亡［9－10］，最近文獻(xiàn)又證明ox－LDL同樣可以引起內(nèi)皮的受損［11］，但受損的機(jī)制尚未闡明；ox－LDL另外一個(gè)重要的機(jī)制則是ROS的形成和氧化應(yīng)激。Ox－LDL能夠提供ROS的豐富來(lái)源，而ROS與組織氧化應(yīng)激和高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，ROS和氧化應(yīng)激在對(duì)包括骨髓干細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞調(diào)控發(fā)揮重要作用［12－14］。

本研究結(jié)果是通過(guò)細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)獲得的，但仍具有緊密的臨床相關(guān)性，最近的臨床研究顯示一個(gè)健康個(gè)體血清中ox－LDL的濃度為7μg／mL，而穩(wěn)定型冠心病患者血清ox－LDL水平則為17.2μg／mL，急性冠脈綜合征患者血清ox－LDL水平更是高達(dá)23.6μg／mL，本實(shí)驗(yàn)選取的 ox－LDL濃度（1～20μg／mL）在健康和患病個(gè)體的平均范圍之內(nèi)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ox－LDL濃度是1μg／mL時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)和增殖沒(méi)有影響，但當(dāng)其濃度增加，出現(xiàn)了抑制作用，并且這種作用與濃度成劑量依賴性，這就提示ox－LDL在這些心血管事件的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)中采用抗氧化劑NAC預(yù)處理來(lái)對(duì)抗ox－LDL對(duì)細(xì)胞的抑制作用，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［13］選取濃度為1mM的NAC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示NAC能夠逆轉(zhuǎn)但不能夠完全恢復(fù)ox－LDL對(duì)MSCs的抑制作用，提示在該過(guò)程中還有其它因素參與其中，下一步作者擬通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究ox－LDL對(duì)MSCs特性和內(nèi)皮分化的影響及其機(jī)制。

本研究明確ox－LDL能夠抑制 MSCs增殖和MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記Oct－4的表達(dá)，而抗氧化劑NAC卻能夠逆轉(zhuǎn)ox－LDL對(duì)MSCs的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了ox－LDL可能通過(guò)氧化應(yīng)激方式抑制MSCs的增殖和細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)，而抗氧化劑使氧化應(yīng)激水平降低甚至消退時(shí)，ox－LDL對(duì)MSCs的抑制作用也隨之降低甚至消退。而研究顯示心血管疾病個(gè)體體內(nèi)EPCs的數(shù)量明顯減少［6－8］，是否與其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化受到抑制導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的生成減少相關(guān)？而Ox－LDL是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管事件發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，在本研究明確ox－LDL抑制MSCs生物學(xué)特性基礎(chǔ)上，擬通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否抑制MSCs的內(nèi)皮分化及其可能機(jī)制。

［1］Urbich C，Dimmeler S.Endothelial progenitor cells：characterization and role in vascular biology［J］.Circ Res，2004，95（4）：343－353.

［2］Jiang Y，Vaessen B，Lenvik T，et al.Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow，muscle，and brain［J］.Exp Hematol，2002，30（8）：896－904.

［3］Breyer A，Estharabadi N，Oki M，et al.Multipotent adult progenitor cell isolation and culture procedures［J］.Exp Hematol，2006，34（11）：1596－1601.

［4］Chu L，Jiang Y，Hao H，et al.Nitric oxide enhances Oct－4 expression in bone marrow stem cells and promotes endothelial differentiation［J］.Eur J Pharmacol，2008，591（1／3）：59－65.

［5］Bhartiya D，Kasiviswanathan S，Unni SK，et al.Newer insights into premeiotic development of germ cells in adult human testis using Oct－4as a stem cell marker［J］.J Histochem Cytochem，2010，58（12）：1093－1106.

［6］Chen JZ，Zhang FR，Tao QM，et al.Number and activity of endothelial progenitor cells from peripheral blood in patients with hypercholesterolaemia［J］.Clin Sci（Lond），2004，107（3）：273－280.

［7］Davignon J，Ganz P.Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis［J］.Circulation，2004，109（23suppl 1）：III－27－III－32.

［8］Wang X，Chen J，Tao Q，et al.Effects of ox－LDL on number and activity of circulating endothelial progenitor cells［J］.Drug Chem Toxicol，2004，27（3）：243－255.

［9］Imanishi THT，Nishio I.Oxidized low－density lipoprotein induces endothelial progenitor cell senescence，leading to cellular dysfunction［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31（7）：407－413.

［10］Chen J，Mehta JL，Haider N，et al.Role of caspases in Ox－LDL－induced apoptotic cascade in human coronary artery endothelial cells［J］.Circ Res，2004，94（3）：370－376.

［11］Chu L，Hao H，Luo M，et al.Ox－LDL modifies the behaviour of bone marrow stem cells and impairs their endothelial differentiation via inhibition of Akt phosphorylation［J］.J Cell Mol Med，2011，15（2）：423－432.

［12］Cominacini L，Garbin U，Pasini AF，et al.Oxidized lowdensity lipoprotein increases the production of intracellular reactive Oxygen species in endothelial cells：inhibitory effect of lacidipine［J］.J Hypertens，1998，16（12Pt 2）：1913－1919.

［13］Heitzer T，Schlinzig T，Krohn K，et al.Endothelial dysfunction，oxidative stress，and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease［J］.Circulation，2001，104（22）：2673－2678.

［14］Itabe H，Ueda M.Measurement of plasma oxidized lowdensity lipoprotein and its clinical implications［J］.J Atheroscler Thromb，2007，14（1）：1－11.