文坤明，傅仲學(xué)

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 遵義 563099；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胃腸外科，重慶 400016)

第3代鉑類制劑奧沙利鉑與5-FU和亞葉酸鈣聯(lián)合應(yīng)用的FOLFOX化療方案使得轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的有效率超過50%，但仍有約40%的病例對(duì)FOLFOX方案無反應(yīng)，出現(xiàn)耐藥[1]。目前，通過建立耐藥細(xì)胞株來研究腫瘤耐藥的機(jī)制及其對(duì)抗或逆轉(zhuǎn)耐藥策略成為目前研究熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中我們建立了一種結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株，檢測了它的多藥耐藥特性及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司；Leibovitz’L-15培養(yǎng)基購自北京邁晨公司；RNA提取試劑盒購自北京天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR TAQ Real time試劑盒購自大連寶生物公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司；兔抗人Oct4、Survivin一抗購自美國Eptomics公司；鼠抗人P-pg一抗購自美國Santa-Cruz公司，鼠抗人β-actin一抗及山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；奧沙利鉑購自美國Sigma公司；WST-1購自瑞士Roche公司。

1.2 耐藥細(xì)胞株的建立方法 SW480細(xì)胞株在含10%FBS的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為建立穩(wěn)定的耐藥細(xì)胞株，在該細(xì)胞的培養(yǎng)液中持續(xù)加入Oxa、并將其濃度由低至高逐漸提高。起始Oxa濃度為0.1 μmol/L，待存活細(xì)胞增殖、細(xì)胞融合度達(dá)80%左右后予傳代，傳3代后增加Oxa濃度(后同)，經(jīng)過提高其濃度為0.5 μmol/L及1.0 μmol/L后，最終達(dá)臨床相關(guān)血藥濃度2.0 μmol/L時(shí)，傳5代以上后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。由SW480細(xì)胞株最終所建立的穩(wěn)定的耐Oxa細(xì)胞株用“SW480/OxR”來表示。

1.3 細(xì)胞增殖活力檢測 采用細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測細(xì)胞增殖能力。按照我們之前報(bào)道的方法[2]，將耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞分別暴露于含2 μmol/L的Oxa及2 μg/L的5-FU培養(yǎng)液中(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，分別在24、48、72 h后加入細(xì)胞增殖試劑WST-1，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定各組細(xì)胞平均吸光度值(A值)，以該A值反映細(xì)胞增殖能力并鑒定SW480/OxR細(xì)胞的耐藥性。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA表達(dá) 用細(xì)胞RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，采用25 μL體系擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后為95 ℃5 s、59 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后65 ℃5 s、95 ℃5 min，進(jìn)行熔解曲線檢測。每次檢測設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次以上。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)水平，內(nèi)參為GAPDH。相關(guān)引物序列(見表1)。

表1 RT-qPCR引物序列

基因名稱引物序列MDR-1上游 5'-GAGGCCAACATACATGCCTTC-3'下游 5'-GTCTAACAAGGGCACGAGCTAT-3'Survivin上游 5'-CCACCGCATCTCTACATTCAAG-3'下游 5'-CAAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'Oct4上游 5'-ACCGAGTGAGAGGCAACC-3'下游 5'-TGAGAAAGGAGACCCAGCAG-3',GAPDH上游 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'下游 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測P-gp、Survivin蛋白表達(dá) 0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，每個(gè)檢測樣本細(xì)胞數(shù)量約為0.5×106，2%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌后用含3%山羊血清蛋白液室溫封閉1 h，PBS洗滌后按1∶50及1∶100稀釋比例分別加入P-gp、Survivin一抗稀釋液100 μL，4 ℃過夜孵育，用1 mLPBS洗滌2次以去除殘留一抗，用100 μLPBS重懸細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的抗鼠二抗(稀釋比例為1∶50)及DyLight549標(biāo)記的抗兔二抗(稀釋比例為1∶200)室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后用100 μLPBS重懸細(xì)胞，送流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Western blot檢測Oct4蛋白水平 采用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞蛋白，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采?0 %的SDS-PAGE膠分離相應(yīng)蛋白，采用濕法轉(zhuǎn)膜45 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入1∶1000稀釋的兔抗人Oct4一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBS洗膜后加入稀釋比例為1∶5000的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后行ECL發(fā)光。選用β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白對(duì)照，采用Quantity-One軟件對(duì)條帶的吸光度值進(jìn)行半定量分析，Oct4蛋白的相對(duì)量用Oct4蛋白條帶的吸光度值/β-actin蛋白條帶的吸光度值表示。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞形態(tài)比較取指數(shù)生長期的細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下照相。由圖1可見，聚集成團(tuán)生長的SW480細(xì)胞間距較小，散在生長細(xì)胞形態(tài)似三角形，而SW480/OxR細(xì)胞之間距離增大，散在生長的細(xì)胞三角形減少，長條形細(xì)胞增多。

注：A:SW480；B:SW480/OxR。 圖1 耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞鏡下形態(tài)(×200)

2.2 化療敏感性檢測結(jié)果 采用細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測細(xì)胞增殖情況結(jié)果提示：①SW480細(xì)胞對(duì)Oxa及5-FU均敏感，與未用化療藥物處理的細(xì)胞比較，隨著時(shí)間推移，加藥后細(xì)胞數(shù)量均逐漸減少。到加入Oxa及5-FU后72 h時(shí)，SW480細(xì)胞存活細(xì)胞百分比分別為(48%±7%)及(52%±6%)，與未加化療藥物的對(duì)照組(Con)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖2)；②SW480/OxR細(xì)胞不僅與期望的結(jié)果一致，對(duì)Oxa耐藥，還對(duì)5-FU也發(fā)生耐藥，到加藥后72 h時(shí)，仍有超過95%的細(xì)胞存活，與未加化療藥物的對(duì)照組(Con)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)，提示SW480/OxR細(xì)胞具有多藥耐藥的特性。

圖2 SW480細(xì)胞加藥72 h后存活細(xì)胞百分比

圖3 SW480/OxR細(xì)胞加藥72 h后存活細(xì)胞百分比

2.3 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA結(jié)果如圖4所示，SW480/OxR細(xì)胞與SW480細(xì)胞比較，MDR-1mRNA增高約6倍(P<0.01)，Survivin-mRNA增高約4倍(P<0.01)，Oct4-mRNA增高約10倍(P<0.01)。

注：*：P<0.01。圖4 RT-qPCR檢測耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞MDR-1、Survivin及Oct4mRNA水平

2.4 P-gp+及Survivin+細(xì)胞比例 流式細(xì)胞技術(shù)間接法檢測結(jié)果提示，SW480細(xì)胞P-gp+及Survivin+細(xì)胞百分率分別為(4.08%±1.62%)及(27.53±2.29%)，而耐藥SW480/OxR細(xì)胞兩個(gè)蛋白陽性細(xì)胞百分率分別增加致(41.62%±4.76%)及(91.87%±5.89%)，與親本細(xì)胞比較，P<0.01。圖5為其中一次檢測結(jié)果。

注：流式細(xì)胞技術(shù)檢測耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞P-gp+及Survivin+細(xì)胞百分率(非RT-qPCR)。圖5 RT-qPCR檢測耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞P-gp+及Survivin+細(xì)胞百分率

2.5 Oct4蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞表達(dá)Oct4蛋白的相對(duì)量為(0.05±0.012)，而耐藥細(xì)胞則增加至(0.27±0.038)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖6為其中一次檢測結(jié)果。

注：A：SW480/OxR；B：SW480。圖6 Western blot檢測耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞Oct4蛋白表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤[3]，手術(shù)和化療是其主要的治療方法。但即使對(duì)結(jié)直腸癌患者實(shí)施了標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)及化療，仍有近50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[4]。對(duì)化療藥物多藥耐藥(MDR)可能是結(jié)直腸癌治療失敗的主要原因之一，關(guān)于MDR的原因及機(jī)制研究是目前惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)。

耐藥細(xì)胞株的建立為研究惡性腫瘤耐藥特性、發(fā)生機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)策略提供了良好的研究對(duì)象[5-6]。我們按照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法，在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480(稱之為親本細(xì)胞)的培養(yǎng)基中逐漸提高化療藥物Oxa的濃度，成功建立了耐Oxa細(xì)胞株SW480/OxR(稱之為耐藥細(xì)胞)。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們比較了耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞以下生物學(xué)特性的差異：①M(fèi)DR特性；②部分耐藥指標(biāo)表達(dá)情況；③干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4的表達(dá)情況，為我們后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)。

我們首先采用細(xì)胞增殖檢測試劑WST-1檢測耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞對(duì)化療藥物(Oxa及5-FU)的敏感性。結(jié)果提示，與未加化療藥物的對(duì)照組(Con)比較，親本細(xì)胞(SW480)在加入臨床血藥濃度的化療藥物(Oxa及5-FU)后，隨著時(shí)間推移，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，到加藥后72 h時(shí)，只有約50%的存活細(xì)胞(P<0.01，見圖2)，說明這兩種細(xì)胞對(duì)化療藥物Oxa及5-FU均敏感；而對(duì)于耐藥細(xì)胞(SW480/OxR)即使到了加藥后72 h，仍有超過95%的細(xì)胞存活(P>0.05，見圖3)，提示這兩種耐Oxa細(xì)胞株不僅對(duì)Oxa耐藥，而且對(duì)5-FU也出現(xiàn)了耐藥，顯示了多藥耐藥(MDR)的特性，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[7]。

P-gp由MDR-1基因編碼，是ABC藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)超家族一員，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)P-gp是腫瘤化療治療失敗的主要障礙之一[6]。P-gp是一種跨膜糖蛋白，通過把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出到胞外，從而降低胞內(nèi)化療藥物的有效濃度[8]。細(xì)胞凋亡由凋亡因子與抗凋亡因子之間的平衡來調(diào)控，細(xì)胞凋亡失控與腫瘤發(fā)生及化療耐藥均有關(guān)[9]。凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一類重要的抗凋亡因子，Survivin是IAP家族中的重要成員。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、直腸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Survivin高表達(dá)提示患者分期晚、預(yù)后差[10]。最近有研究發(fā)現(xiàn)[11]，雷帕霉素可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)Survivin，后者可保護(hù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在雷帕霉素作用下不凋亡。我們采用RT-qPCR檢測耐藥基因MDR-1及凋亡抑制基因Survivin的mRNA結(jié)果提示：SW480/OxR細(xì)胞與SW480細(xì)胞比較，MDR-1mRNA增高約6倍，Survivin-mRNA增高約4倍。流式細(xì)胞技術(shù)檢測相應(yīng)蛋白陽性細(xì)胞百分比結(jié)果也呈相同趨勢變化：SW480/OxR細(xì)胞與SW480細(xì)胞比較，P-gp+細(xì)胞比例由(4.08%±1.62%)增加到(41.62%±4.76%)(P<0.01)，而Survivin+細(xì)胞比例則由(27.53%±2.29%)增加到(91.87%±5.89%)(P<0.01)，提示P-gp和Survivin蛋白可能在結(jié)直腸癌耐藥中起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)[12]，Oct4基因是維持胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ES)多能性及自我更新主要調(diào)節(jié)劑。Oct4在多能的ES細(xì)胞中高表達(dá)，在ES細(xì)胞分化時(shí)Oct4下調(diào)，敲出Oct4基因后使ES細(xì)胞分化[13]。因此，調(diào)節(jié)ES細(xì)胞多能性及自我更新賦予Oct4作為多能性的標(biāo)志。近來，越來越多的報(bào)道顯示Oct4在部分惡性實(shí)體腫瘤，如乳腺癌、肺癌[14]及結(jié)直腸癌[15]等中有異常表達(dá),并且與腫瘤的預(yù)后有密切的相關(guān)性。Ong CW等[15]對(duì)1990～1999年在該院行外科手術(shù)治療切除的501例結(jié)直腸癌患者的石蠟切片用免疫組化方法檢測干細(xì)胞相關(guān)因子CD133、Oct-4及Sox-2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤CD133及Oct-4陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者差的預(yù)后相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)CD133+腫瘤對(duì)5-FU化療更容易耐藥。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的鼠肺癌3LL細(xì)胞及人乳腺癌MCF7細(xì)胞均高表達(dá)Oct-4。他們把這兩種高表達(dá)Oct-4的細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(Cancer stem cell-like cells，CSCLCs)。他們采用RNAi技術(shù)沉默這兩種細(xì)胞的Oct-4基因，結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加，裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中腫瘤生長明顯受抑制。研究還發(fā)現(xiàn)，Oct4在前列腺癌[16]、肝癌[17]等惡性腫瘤中高表達(dá)與腫瘤耐藥有關(guān)。以上研究說明Oct4在維持CSCLCs存活及惡性腫瘤耐藥中起重要作用。我們采用RT-qPCR及Western blot技術(shù)檢測了Oct4的mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果二者在耐藥細(xì)胞表達(dá)均明顯高于其親本細(xì)胞，見實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3及2.5。

綜上所述，我們所建立的耐奧沙利鉑細(xì)胞株具有多藥耐藥的特性，可能與高表達(dá)耐藥蛋白P-gp、抗凋亡蛋白Survivin及干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4有關(guān)。

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