孔 萌，劉遠(yuǎn)梅, 金 祝,曲 顏，鄭澤兵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 小兒普胸泌外科，貴州 遵義 563099)

先天性肛門直腸畸形 (anorectal malformation, ARM)是小兒最常見的消化道畸形之一[1]，雖本病的治愈率已顯著提高，但術(shù)后部分ARM患兒仍可出現(xiàn)不同程度的污糞、便秘等排便功能障礙，給患兒的生活質(zhì)量帶來較大影響。目前已證實ARM患兒術(shù)后排便功能障礙與腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system, ENS)發(fā)育異常密切相關(guān)[2]，而ENS發(fā)育異常又是如何影響其排便功能，作用機(jī)制仍不十分清楚。ENS起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞，進(jìn)入腸道后逐漸遷移、增殖，緩慢集聚最終分化形成神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞[3]，在此過程中任何環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可影響神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)而導(dǎo)致ENS發(fā)育不良。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與神經(jīng)元的增殖、分化、遷移、再生和修復(fù)，可影響ENS的發(fā)育，ATP功能的發(fā)揮必須與相應(yīng)P2Y2受體結(jié)合[4]，P2Y2受體的多少可以間接反映ATP神經(jīng)遞質(zhì)的功能。本實驗通過乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)制作ARM動物模型[5]，觀察P2Y2受體在ARM胎鼠直腸末端中分布、表達(dá)情況，進(jìn)一步探討其在腸壁神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 ARM動物模型的建立及分組 選用健康未經(jīng)產(chǎn)成年SD大鼠40只(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，SPF級)，其中雌鼠30只，雄鼠10只，體重200～250g，雌雄大鼠按3∶1 比例于晚10點合籠交配，次日清晨8點行雌鼠陰道涂片，光學(xué)顯微鏡(×100)暗視野下以見到精子記為孕0d，每只孕鼠分別于妊娠第0天和第10天進(jìn)行稱重，增重不明顯的孕鼠不包括在本實驗內(nèi)，以排除流產(chǎn)和假孕現(xiàn)象。選取明確受孕的20只雌鼠隨機(jī)分成兩組：實驗組與正常組各10只，實驗組在孕10d 一次性灌胃注入125mg/kg的1%乙烯硫脲，正常組在孕10d灌胃注入等量生理鹽水。兩組孕鼠在孕20d剖宮取出所有宮內(nèi)胎鼠，觀察有無畸形，并取出部分胎鼠直腸末端保存于-80℃冰箱，其余標(biāo)本用4%甲醛溶液固定12～36h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.2 主要儀器及試劑 實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)(德國Forma Scientic)、雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國GDYSSEY公司)、光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)、ETU(Sigma，1504-I00G)、DEPC原液(Sigma St.Louis MO)、RT-PCR試劑盒(大連寶生物試劑公司)、免疫組化染色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、兔抗鼠P2Y2單克隆抗體(北京博奧生物公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色 對石蠟包埋好的盆腔會陰部組織及直腸末端組織進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為4 μm，常規(guī)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察兩組胎鼠直腸末端組織結(jié)構(gòu)變化并分別取10個樣本切片，每張切片隨機(jī)選取10個視野，計算出肌間及黏膜下神經(jīng)元的數(shù)目，然后求10個視野平均值作該樣本的表達(dá)量。

1.3.2 Western blot 檢測 選取ARM組及正常組標(biāo)本各10例，應(yīng)用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。Western blot雜交：取總蛋白60 μL，經(jīng)10% SDS-PAGE后移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原后，加兔抗鼠P2Y2(1∶200)和β-actin 抗體(1∶1000)，4 ℃孵育12 h，然后用800cw標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶10000)行二抗雜交，采用雙紅外激光成像系統(tǒng)掃描圖像并對蛋白含量進(jìn)行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達(dá)量。

1.3.3 qRT-PCR檢測 基因引物由大連寶生物公司協(xié)助合成，β-actin基因，5′-GGA GATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′、5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′, 擴(kuò)增長度150bp；P2Y2基因：5′-CTCATTTGGCAGGGACTCAGG-3′、5′- AATGGCA GCTGTTTGCATGG-3′，擴(kuò)增長度141bp，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行總RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。結(jié)果計算：測定每個樣本P2Y2、β-actin基因的Ct值，計算該基因相對定量，確定各基因擴(kuò)增效率在90%～105%，相關(guān)系數(shù)︱r︱>0.99，滿足2^(-ΔCt)(參照基因的ΔCt法)相對定量分析的前提。以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)計算下列數(shù)據(jù)：①Ct average =(Ct1+Ct2)/2(復(fù)管)；②dCt =Ct average-中間值；③基因的表達(dá)=2^(-dCt)；④相對定量=目的基因/內(nèi)參基因(β-actin)的表達(dá)×100。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 正常組共產(chǎn)胎鼠108只，存活率100%，未見任何畸形發(fā)生；實驗組共產(chǎn)胎仔94只，存活率93.6%，存活胎鼠中ARM發(fā)生率96.8%。

2.2 HE染色 正常組胎鼠肛門開口正常，肛門周圍肌肉輪廓清楚，直腸各層組織分化好(見圖1A)，ARM胎鼠直腸末端為一閉合盲端，無正常肛門結(jié)構(gòu)(見圖1B)；正常組胎鼠直腸末端黏膜下和肌間神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目多，核體積大，呈圓形或橢圓形，染色深，胞漿豐富，軸突清晰可見(見圖1C)；ARM組各層組織結(jié)構(gòu)分層不清，可見較多空腔，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較少，核體積小，固縮，染色淺，呈不規(guī)則形，分布稀疏，軸突及胞漿少(見圖1D)，ARM組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較正常組明顯減少(143.60±14.93 vs 335.90±10.46，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

注：A：正常組矢狀面：肛門開口正常，輪廓清晰；B：ARM組矢狀面：肛門開口處為一閉合盲端 ；C：正常組直腸末端腸壁各層分化好；D：ARM組胎鼠直腸末端腸壁黏膜下肌間神經(jīng)元數(shù)量較少，層次不清，(放大倍數(shù)A-B：HE×40，C-D：HE×400)。圖1 正常組和ARM組胎鼠盆腔會陰部和直腸末端HE染色結(jié)果

分組黏膜下和肌間神經(jīng)元數(shù)目正常組ARM組335.90±10.46 143.60±14.93*tP10.5 0.00

注：*與對照組相比，P<0.01。

2.3 Western blot結(jié)果 P2Y2在ARM胎鼠直腸末端的蛋白表達(dá)量均明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

注：1、2、3、4、為ARM組；5、6、7、8為對照組。圖2 P2Y2、β-actin蛋白定量結(jié)果

2.4 qRT-PCR結(jié)果 P2Y2 mRNA在ARM組胎鼠直腸末端組織中的相對表達(dá)量明顯低于正常組，P<0.01(見圖3，表2)。

分組 蛋白量mRNA正常組0.42±0.0598.53±52.25ARM組0.23±0.06*49.40±26.49*t-4.64-2.37P 0.00 0.03

注：*與正常組相比，P<0.05。

注：A:擴(kuò)增曲線 ；B：溶解曲線。圖3 qRT-PCR擴(kuò)增/溶解結(jié)果

3 討論

先天性肛門直腸畸形是世界衛(wèi)生組織重點監(jiān)測的先天性畸形，過去人們常常認(rèn)為ARM患兒術(shù)后排便功能障礙與術(shù)后巨結(jié)腸、巨直腸或直腸無力有關(guān)[6]?，F(xiàn)有研究表明直腸末端腸神經(jīng)發(fā)育異常是導(dǎo)致ARM患兒術(shù)后排便功能障礙的重要原因之一[7]，而腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的機(jī)制目前仍不十分清楚。腸神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)元、神經(jīng)遞質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，保持神經(jīng)元之間的信息順利傳遞，腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元可通過分泌興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)來調(diào)節(jié)胃腸道功能，神經(jīng)遞質(zhì)缺失會導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，導(dǎo)致腸道動力障礙性疾病的發(fā)生。

ATP是腸管非腎上腺素能、非膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)(non-adrenergic noncholinergic nerues, NANC)釋放的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是重要的嘌呤突觸傳遞。它和血管活性腸肽(VIP)、一氧化氮(NO)都是胃腸道NANC抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于胃腸道及其它各種組織中，對腸神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、分化、遷移、修復(fù)等活動起重要作用。所以，ATP可作為ENS發(fā)育的重要指標(biāo)之一，但其功能的發(fā)揮必須與相應(yīng)的受體相結(jié)合。P2Y2作為其重要受體之一，在胃腸道內(nèi)分布最為廣泛[8]，因此,P2Y2受體的多少可以間接反映腸道ATP神經(jīng)遞質(zhì)的功能。

目前，國內(nèi)外的研究表明ATP可通過與P2Y2受體結(jié)合促進(jìn)神經(jīng)軸突的外向生長。 Arthur等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ATP激活P2Y2后，引起酪氨酸激酶受體A(TrkA)和P2Y2受體共區(qū)域化和聯(lián)系，增強(qiáng)了神經(jīng)元的生長、分化、移行等過程。Thornton等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠回腸內(nèi)引起的慢興奮性突觸后電位被P2Y受體拮抗劑阻斷后，隨即出現(xiàn)在NOS(一氧化氮合酶)陽性的下行神經(jīng)元，研究提示P2Y參與下行傳導(dǎo)。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)豚鼠肌間和黏膜下神經(jīng)叢P2Y2表達(dá)的部位也有NOS表達(dá)[11]，沒有P2Y2表達(dá)的區(qū)域也沒有NOS的表達(dá)，這些研究表明同為腸神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，ATP可能與NOS存在著相似的功能。此后，Donnell等[12]在先天性巨結(jié)腸的研究中發(fā)現(xiàn)P2Y2在先天性巨結(jié)腸腸壁內(nèi)有表達(dá)，并且在病變腸管中表達(dá)量較正常腸管明顯減少，推測P2Y2受體缺乏可導(dǎo)致腸管的松弛功能障礙，從而使腸管處于持續(xù)痙攣狀態(tài)。但對于ATP及其受體P2Y2在ARM直腸末端內(nèi)的表達(dá)及其作用，目前尚未見報道。

本實驗通過觀察P2Y2在ARM胎鼠直腸末端的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)P2Y2在直腸末端黏膜下及肌間神經(jīng)叢胞質(zhì)中有表達(dá)，在正常組呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而在ARM組呈弱陽性反應(yīng)，ARM組直腸末端黏膜下及肌間神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)目明顯少于正常組，說明了ETU成功誘導(dǎo)ARM胎鼠的發(fā)生。Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示P2Y2蛋白及mRNA量在ARM組中的表達(dá)較正常組明顯降低，推測ARM患兒術(shù)后便秘的發(fā)生可能是P2Y2表達(dá)下調(diào)、影響與ATP神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)合，從而干擾其功能的發(fā)揮，導(dǎo)致直腸末端腸管的松弛作用功能發(fā)生障礙，使腸管處于持續(xù)性痙攣狀態(tài)，這表明P2Y2可能參與并影響ARM胎鼠直腸末端腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。本實驗僅研究了P2Y2受體在ARM胎鼠直腸未端的表達(dá)，未對ATP神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行檢測。對于ATP的表達(dá)是否也存在異常以及兩者之間的聯(lián)系將是本課題組進(jìn)一步研究的方向。

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