劉 毅，寧尚磊，陳雨信，徐克森，壽楠海

山東大學(xué) 齊魯醫(yī)院肝膽外科，濟(jì)南250012

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一［1］。肝部分切除是目前治療肝癌最有效的局部治療手段之一。雖然肝臟外科技術(shù)取得較大進(jìn)展，但接受肝部分切除的患者術(shù)后5年內(nèi)仍有50%～60%死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這已成為影響肝癌患者術(shù)后療效和獲得長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵因素之一。在肝切除手術(shù)中，術(shù)中出血幾乎不可避免，而出血量的多少被認(rèn)為是術(shù)后恢復(fù)和預(yù)測(cè)預(yù)后的重要指標(biāo)，因此控制切肝過程中出血的各種方法在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用［2］，但這又會(huì)導(dǎo)致整個(gè)或部分肝臟缺血再灌注的發(fā)生。Ku等［3］及Yoshimoto等［4］報(bào)道手術(shù)相關(guān)缺血再灌注損傷會(huì)對(duì)大鼠肝臟腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。van der Bilt等［5］觀察到再灌注后期肝實(shí)質(zhì)的壞死而非早期的肝實(shí)質(zhì)損傷是造成肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。目前缺血再灌注影響肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，Lenglet等［6］、Tamagawa 等［7］及 van der Bilt等［8］認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與缺血再灌注導(dǎo)致再灌注的肝組織內(nèi)某些分子表達(dá)上調(diào)有關(guān)。有研究表明肝移植時(shí)肝臟缺血再灌注損傷會(huì)誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)過表達(dá)［9-10］。VCAM-1作為一種促進(jìn)異種細(xì)胞間黏附的黏附因子，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［9］。在體外實(shí)驗(yàn)中，VCAM-1介導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞黏附于小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞的效率被認(rèn)為與這些癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)［9］。而這種黏附效率是建立腫瘤轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的因素之一。本研究采用部分肝蒂阻斷法誘導(dǎo)70%肝臟出現(xiàn)缺血再灌注損傷，后經(jīng)門靜脈注射H22肝癌細(xì)胞后不同時(shí)間段，觀察缺血再灌注損傷對(duì)肝癌細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移的影響，同時(shí)在再灌注2和8 h檢測(cè)各組缺血肝組織的肝酶、VCAM-1表達(dá)情況及組織病理學(xué)檢查，為臨床進(jìn)一步探討肝臟血流阻斷對(duì)腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移的影響及改進(jìn)手術(shù)方式提供初步的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 H22-H8D8肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞中心，VCAM-1為Santa Crus(USA)產(chǎn)品，免疫組織化學(xué)染色試劑盒Histostain-Plus Rabbit Primary購(gòu)自Invitrogen公司 (USA)。

肝臟缺血再灌注并肝癌門靜脈轉(zhuǎn)移模型的制作 120

只6～7周齡雄性Balb/C小鼠 (25～30 g)，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，水合氯醛300 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，參照van der Bilt等［5］的方法并做適當(dāng)改進(jìn)，建立小鼠肝臟部分缺血再灌注模型:取正中切口，剪開尾狀葉與左肝葉之間的韌帶，顯露左肝和中肝的肝蒂，用無創(chuàng)微血管夾阻斷中肝葉及左肝葉血流，造成70%肝臟缺血，不阻斷右肝及尾狀葉血流，缺血再灌注一定時(shí)間 (30或45 min)后，1 ml針管 (29G針頭)將H22小鼠肝癌細(xì)胞株5×105細(xì)胞 (50μl)注入門靜脈主干后關(guān)腹。

分組 將Balb/C小鼠按照完全隨機(jī)分組的方法分為3組，每組小鼠40只，分別為假手術(shù)組:解剖出供應(yīng)左肝和中肝的肝蒂但不阻斷，60 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈;缺血30 min組:肝蒂阻斷30 min再灌注30 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈;缺血45 min組:肝蒂阻斷45 min再灌注30 min后將肝癌細(xì)胞注入門靜脈。各組小鼠分別于再灌注后2 h、8 h、7 d、14 d后處死 (每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死10只)。肝葉分別放入10%中性甲醛或液氮中進(jìn)行速凍，貯存于－80℃深低溫冰箱中備測(cè)。

肝臟酶學(xué)的檢測(cè) 再灌注后2和8 h取各組左肝葉應(yīng)用診斷用酶試劑盒 (北京綠源博德生物科技有限公司)檢測(cè)各組肝葉勻漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。

HE染色 術(shù)后7 d處死動(dòng)物，標(biāo)本脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。

免疫組織化學(xué)染色 再灌注后2和8 h，取各組左肝葉 (缺血肝)，采用免疫組織化學(xué)加強(qiáng)型鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶法，檢測(cè)肝組織中VCAM-1蛋白的表達(dá)情況。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VCAM-1 mRNA 再灌注后2和8 h，取各組左肝葉 (缺血肝)，提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，引物設(shè)計(jì)軟件5.0，北京賽百盛公司合成。引物序列如下:βactin(93bp)上游引物:5’-CAGAAGGAGATTACTGCTCTGGCT-3’，下游引物:5’-GGAGCCACCGATCCACACA-3’;VCAM-1(387bp)上游引物:5’-TCGCGGTCTTGGGAGCCTCA-3’，下游引物:5’-CCGTGACCGGCTTCCCAACC-3’。擴(kuò)增在GeneAmp 5700熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件:95.0℃ 10 min，95.0℃ 25 s，55.0℃ 25 s，72.0℃ 50 s，72.0℃ 5 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，電腦自動(dòng)記錄反應(yīng)管中的熒光信號(hào)值，反應(yīng)結(jié)束由PE 5700軟件分析結(jié)果。

肝臟受侵犯面積測(cè)定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，肝臟轉(zhuǎn)移灶形式各異，單純用腫瘤的數(shù)目或體積很難對(duì)腫瘤負(fù)荷情況進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估，故采用肝臟受侵犯面積 (hepatic replacement area，HRA)作為肝臟腫瘤負(fù)荷的評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］。隨機(jī)選取各組HE切片，在低倍顯微鏡下計(jì)算該視野下腫瘤所侵犯的面積占視野中肝臟面積的百分比。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad.Prism.v5.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，兩個(gè)變量之間相關(guān)性用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

缺血再灌注對(duì)肝功能的影響 肝臟缺血再灌注2 h后，缺血45 min組和缺血30 min組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著高于假手術(shù)組 (P均＜0.05)，且缺血45 min組較缺血30 min組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平變化更加明顯 (P均＜0.05)。假手術(shù)組術(shù)后谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均一過性輕度升高，缺血45 min組和缺血30 min組谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平在8 h表達(dá)均較2 h時(shí)高 (P均＜0.05)(圖1)。

缺血再灌注對(duì)荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響 缺血30 min組中2/10小鼠在術(shù)后14 d存活，假手術(shù)組中6/10小鼠術(shù)后14 d存活。中位生存時(shí)間:假手術(shù)組16.3 d，缺血30 min組12.1 d，缺血45 min組9.6 d，假手術(shù)組與缺血30 min組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)，缺血30 min組與缺血45 min組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.055)(圖2)。

圖1 不同處理方式對(duì)肝功能的影響Fig 1 Influence of different treatment modes on the liver function

缺血再灌注對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞門靜脈侵襲轉(zhuǎn)移的影響 大體標(biāo)本觀察顯示缺血30 min組術(shù)后14 d幾乎均存在肝臟轉(zhuǎn)移 (9/10)，肝臟普遍增大，腫瘤面積較假手術(shù)組大，多數(shù)呈結(jié)節(jié)型，灰白色，質(zhì)硬、脆，浸潤(rùn)性或膨脹性生長(zhǎng);假手術(shù)組3/10存在肝腫瘤轉(zhuǎn)移，肝葉較缺血30 min組小，腫瘤面積較小，多成點(diǎn)狀或小結(jié)節(jié)狀。組織學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞壞死存在于幾乎所有荷瘤小鼠的肝葉中，假手術(shù)組為點(diǎn)狀或小片狀壞死占整個(gè)肝面積的5%～7%，缺血30 min組壞死灶多為團(tuán)狀或大片狀，占整個(gè)肝面積的15%～25%，壞死灶通常出現(xiàn)在腫瘤周圍伴較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) (圖3)。假手術(shù)組左肝葉的HRA較缺血30 min組顯著減少 (P=0.032)，但假手術(shù)組右肝葉的HRA與缺血30 min組右肝葉比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.089);缺血45 min組左肝葉的腫瘤負(fù)荷較缺血30 min組和假手術(shù)組高 (P=0.013，P=0.007)(圖4)。

缺血再灌注時(shí)間對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞門靜脈侵襲轉(zhuǎn)移的影響 缺血45 min組中位生存時(shí)間9.6 d與缺血30 min組12.1 d比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.055)，僅有1只小鼠生存期超過14 d(圖2);HE染色顯示缺血45 min組的肝葉被侵犯面積最多 (29.7±13.3)%，壞死面積更大 (25% ～35%)(圖3)。

缺血再灌注對(duì)肝組織VCAM-1表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，胞膜和胞漿呈黃褐色為VCAM-1陽性細(xì)胞，主要見于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、少部分白細(xì)胞和肝細(xì)胞 (圖5)。缺血45 min組VCAM-1蛋白水平在再灌注8 h時(shí)明顯高于缺血30 min組和假手術(shù)組(P均＜0.05)(圖6)。對(duì)VCAM-1蛋白和HRA進(jìn)行Spearman分析顯示兩者呈正相關(guān) (r=0.491，P=0.045)。再灌注8 h時(shí)，缺血30 min組中VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平是假手術(shù)組的4倍以上，缺血45 min組在再灌注2和8 h時(shí)，VCAM-1的表達(dá)水平均明顯高于缺血30 min組和假手術(shù)組 (P均＜0.05)(圖7)。

圖2 不同處理組小鼠生存時(shí)間比較Fig 2 Survival time in different groups

圖3 不同處理方式對(duì)小鼠肝癌門靜脈轉(zhuǎn)移的影響 (術(shù)后第7天)(HE染色，×100)Fig 3 Tumor growth and metastasis on the portal vein metastasis in mice with different treatment modes(7 days after operation)(HE×100)

圖4 術(shù)后7 d各組HRA比較Fig 4 HRA on different groups 7 d after operation

圖5 不同處理組再灌注8 h時(shí)，VCAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×200)Fig 5 VCAM-1 immunostaining 8 hours after hepatic ischemia/reperfusion with different treatment modes(×200)

圖6 不同處理方式在術(shù)后8 h對(duì)各組VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)定量分析結(jié)果Fig 6 Quantitative analysis on the VCAM-1-positive cells in different groups by different treatment modes 8 h after operation

圖7 不同處理方式在術(shù)后2、8 h各組小鼠VCAM-1 mRNA表達(dá)情況Fig 7 VCAM-1 mRNA expression in different groups by different treatment modes 2 and 8 hours after operation

討 論

近年來，雖然各種新的治療肝癌的手段不斷涌現(xiàn)，肝切除術(shù)仍然在根治性肝癌局部治療方法中占據(jù)主導(dǎo)地位［1-2］。然而目前肝癌術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率達(dá)50% ～60%［2］，肝癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前導(dǎo)致肝癌患者術(shù)后死亡的主要因素［1］。肝癌切除不徹底、術(shù)后殘留腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，是肝癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的最直接原因。但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)很多實(shí)現(xiàn)根治性切除的肝癌患者術(shù)后大多會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提示存在其他因素誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

本研究證實(shí)肝臟缺血再灌注能夠促進(jìn)H22細(xì)胞肝臟門靜脈轉(zhuǎn)移。首先缺血30 min組腫瘤侵犯面積遠(yuǎn)較假手術(shù)組多，缺血45 min組與缺血30 min組在腫瘤負(fù)荷方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即缺血再灌注能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移且與缺血時(shí)間呈正相關(guān);其次研究顯示腫瘤一般最先出現(xiàn)在缺血肝葉臟面的邊緣處，后期遍布整個(gè)肝臟。筆者認(rèn)為這是由于缺血肝葉邊緣處相對(duì)于肝臟其他部位對(duì)缺血再灌注更為敏感的緣故，還可能因該處微血管管徑細(xì)小，由于機(jī)械原因腫瘤細(xì)胞在此處滯留時(shí)間較長(zhǎng)。另外本研究顯示缺血組的右肝 (非缺血肝葉)和假手術(shù)組的右肝相比，腫瘤負(fù)荷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與van der Bilt等［8］研究結(jié)果不一致，van der Bilt等［8］將RCH-H4結(jié)腸癌細(xì)胞注射入大鼠脾實(shí)質(zhì)，3 d后進(jìn)行缺血再灌注，結(jié)果顯示缺血組的非缺血肝葉較假手術(shù)組的肝葉腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移率高，他們認(rèn)為可能與肝缺血再灌注產(chǎn)生的某些誘導(dǎo)因子被釋放入血，到達(dá)非缺血肝葉，加速了腫瘤轉(zhuǎn)移，而本研究結(jié)果提示肝臟缺血再灌注對(duì)于循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移內(nèi)在機(jī)制局限于缺血組織的局部與系統(tǒng)釋放因子無關(guān)。這種差異筆者認(rèn)為可能與選擇的模型及動(dòng)物品種的不同有關(guān)。

VCAM-1是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞表面表達(dá)，主要介導(dǎo)異型細(xì)胞黏附等作用［9］。本研究在基因和蛋白兩個(gè)水平上檢測(cè)VCAM-1隨肝臟缺血時(shí)間的變化情況。VCAM-1的表達(dá)活性在再灌注2 h時(shí)開始升高，到8 h達(dá)到高峰，缺血時(shí)間越長(zhǎng)，VCAM-1表達(dá)量越高，對(duì)VCAM-1蛋白和HRA進(jìn)行Spearman分析，提示兩者存在正相關(guān)。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等受缺血再灌注刺激后上調(diào)VCAM-1表達(dá)，能夠增加腫瘤細(xì)胞在肝竇和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)時(shí)的黏附，引起內(nèi)皮細(xì)胞回縮，暴露細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)移［9］。VCAM-1隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)升高，部分解釋了缺血再灌注能夠促進(jìn)腫瘤門靜脈轉(zhuǎn)移的原因。

綜上，本研究證實(shí)肝臟缺血再灌注可以促進(jìn)小鼠腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移的發(fā)生。VCAM-1表達(dá)升高與腫瘤細(xì)胞門靜脈轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因?yàn)檗D(zhuǎn)移的腫瘤負(fù)荷和VCAM-1的表達(dá)隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，故縮短肝門阻斷時(shí)間可能有利于減少肝外科手術(shù)中腫瘤的門靜脈轉(zhuǎn)移。

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