楊 娜，王琳琳，袁 悅，葉榮偉，任愛國(guó)

北京大學(xué)生育健康研究所 衛(wèi)生部生育健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京100191

盡管有研究顯示圍產(chǎn)期補(bǔ)充葉酸可以減少神經(jīng)管畸形的發(fā)生率［1-2］，但大多數(shù)新生兒神經(jīng)管畸形患兒的母親在孕期并未出現(xiàn)血葉酸缺乏［3-4］。葉酸受體是介導(dǎo)葉酸進(jìn)入細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，在母體胎兒葉酸傳遞過程中發(fā)揮重要作用。2004年，Rothenberg等［5］報(bào)道人體內(nèi)的葉酸受體自身抗體與神經(jīng)管畸形有關(guān)。此后，多項(xiàng)研究顯示葉酸受體抗體可能與唇腭裂、孤獨(dú)癥、腦葉酸缺乏綜合征等相關(guān)［6-8］，尚需要大樣本量流行病學(xué)研究證實(shí)這種相關(guān)性。在進(jìn)行人群研究時(shí)，需要一種可靠、高通量的葉酸受體自身抗體檢測(cè)方法。目前，葉酸受體抗體的檢測(cè)方法有放射性同位素標(biāo)記法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。放射性同位素標(biāo)記法的操作復(fù)雜［5］，不適合大樣本研究。目前，在ELISA檢測(cè)葉酸受體自身抗體時(shí)，商品化的包被蛋白只有牛源葉酸結(jié)合蛋白，如何獲得高純度的人葉酸受體蛋白是關(guān)鍵。本課題組已經(jīng)成功建立了從健康人胎盤中提取并純化葉酸受體蛋白的方法［9］。本研究旨在建立ELISA檢測(cè)血漿中葉酸受體自身抗體IgM的方法，并對(duì)該方法的靈敏度、精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

材料和方法

葉酸受體包被 人葉酸受體的提取及純化方法參見文獻(xiàn) ［9］。用PBS緩沖液 (pH 7.4)稀釋從胎盤中提取的葉酸受體蛋白至5 ng/μl，4 μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。含有Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液 (tris buffered saline with tween-20，TNT)(pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，Tween-20 0.5 ml，用雙蒸水定容至1 L)洗板后，每孔加入100 μl 5%的牛血清白蛋白，孵育30 min封閉非特異位點(diǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)品或樣品處理 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品血漿均按1∶1比例加入活性炭，除去葉酸。目前，尚無商品化的檢測(cè)葉酸受體抗體的標(biāo)準(zhǔn)品。研究顯示隨著年齡增長(zhǎng)，血液中會(huì)出現(xiàn)某些自身抗體 (包括葉酸受體自身抗體)，并且抗體含量也會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)變化［10］。本研究采用的葉酸受體自身抗體標(biāo)準(zhǔn)品為山西省昔陽婦幼保健院采集的健康人EDTA抗凝血漿，用TNT緩沖液稀釋后葉酸受體抗體 IgM濃度分別為6.25×10－4、1.25 × 10－3、2.50 × 10－3、5.00 × 10－3、1.00 × 10－2、2.00×10－2、4.00 ×10－2和8.00 ×10－2，將原始混合血漿中葉酸受體抗體IgM濃度設(shè)定為1。陰性對(duì)照為TNT緩沖液。根據(jù)來源選擇樣品 (山西省昔陽婦幼保健院)的合適稀釋倍數(shù)，通常用TNT緩沖液稀釋80～320倍。按50 μl/孔將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板。標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，室溫下孵育18 h。

辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM結(jié)合 用TNT緩沖液沖洗未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，加入1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育1 h。

樣品檢測(cè) 用TNT緩沖液和三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液 (pH 7.6，1 mol/L Tris，5 mol/L Nacl，用雙蒸水定容至1 L)先后洗板，加Femto底物 (SuperSignal ELISA Femto，Thermo Scientific Pierce，美國(guó))顯色，在Synergy2多功能酶標(biāo)儀 (美國(guó)Biotek公司)上檢測(cè)各孔發(fā)光信號(hào)值。

數(shù)據(jù)分析 以標(biāo)準(zhǔn)品葉酸受體抗體IgM濃度的自然對(duì)數(shù)值為自變量，以發(fā)光信號(hào)值為因變量，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用二次多項(xiàng)式擬合，得到血漿葉酸受體抗體IgM濃度的擬合方程。根據(jù)樣品信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置得出樣品中葉酸受體抗體IgM濃度。

檢測(cè)限分析 以空白濃度測(cè)量值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示在適當(dāng)?shù)闹眯潘絻?nèi)能從樣品中檢出的待測(cè)組分的最小量［11］。

精密度分析 用批內(nèi)差異與批間差異表示該方法檢測(cè)血漿葉酸受體抗體IgM濃度的精密度，方法參照文獻(xiàn) ［12-13］。對(duì)高、中、低3個(gè)不同濃度的血漿樣本連續(xù)檢測(cè)3批，每批每個(gè)樣本設(shè)8個(gè)平行樣本。

穩(wěn)定性分析 對(duì)高、中、低3個(gè)不同濃度的血漿樣本分別按1∶80、1∶160、1∶320稀釋，測(cè)定樣品的葉酸受體抗體IgM濃度。每個(gè)稀釋倍數(shù)設(shè)3個(gè)平行樣本。

不同包被蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 分別采用人葉酸受體和牛源葉酸結(jié)合蛋白作為包被蛋白，檢測(cè)山西省昔陽婦幼保健院收集的24例健康新生兒母親和20例神經(jīng)管畸形患兒母親的血漿標(biāo)本，比較兩種不同包被蛋白對(duì)ELISA檢測(cè)血漿葉酸受體抗體IgM濃度的影響。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料均數(shù)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)量資料相關(guān)分析用Pearson相關(guān)。取雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 ELISA方法檢測(cè)血漿葉酸受體抗體IgM濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve for measuring the concentration of human IgM autoantibody to folate receptor

結(jié) 果

工作曲線 血漿葉酸受體抗體IgM濃度的擬合方程為y=1 680.2x2+27 858x+116 518，R2=0.9958。該工作曲線可測(cè)定的血漿葉酸受體抗體IgM濃度范圍為6.25×10－4～8×10－2(標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1)(圖1)。

檢測(cè)限 該方法能檢測(cè)到的血漿葉酸受體抗體IgM濃度的最小量為3.12×10－4。

精密度 該方法檢測(cè)高、中和低濃度血清葉酸受體自身抗體IgM的批內(nèi)差異分別為6.61%、3.50%和5.12%(表1)。該方法檢測(cè)的高、中和低濃度血清葉酸受體自身抗體IgM的濃度分別為2.13±0.10、0.90±0.05和0.50±0.03，批間差異分別為4.54%、5.49%和5.44%。

穩(wěn)定性 采用此方法檢測(cè)高、中、低濃度樣本中葉酸受體自身抗體IgM的濃度，采用不同稀釋倍數(shù)時(shí)測(cè)定值均較穩(wěn)定。對(duì)于高濃度樣本，稀釋倍數(shù)為1∶80、1∶160、1∶320時(shí)測(cè)定值分別為1.88、1.77、1.97，在均數(shù)±10%范圍內(nèi) (1.69～2.06);對(duì)于中濃度樣本，稀釋倍數(shù)為 1∶80、1∶160、1∶320時(shí)測(cè)定值分別為0.89、0.99、0.81，在均數(shù) ±10%范圍內(nèi) (0.81～0.98);低濃度樣本80倍稀釋時(shí)，3次測(cè)定值分別為0.46、0.52、0.49，在均數(shù)±10%范圍內(nèi) (0.40～0.49)。稀釋倍數(shù)對(duì)高、中、低濃度樣本測(cè)量結(jié)果影響均較小。

包被蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 采用人葉酸受體包被檢測(cè)板測(cè)得的健康新生兒母親葉酸受體抗體IgM濃度為1.43±0.31，顯著高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測(cè)板的測(cè)定值1.18±0.28(t=－11.9，P＜0.001)，前者的結(jié)果比后者高21%。人葉酸受體包被檢測(cè)板測(cè)得的神經(jīng)管畸形患兒母親的IgM濃度為5.43±1.82，顯著高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測(cè)板的測(cè)定值3.21±0.91(t=7.35，P＜0.001)，前者的結(jié)果比后者高69%。Pearson相關(guān)分析顯示:不論對(duì)健康新生兒母親還是神經(jīng)管畸形患兒母親，兩種方法檢測(cè)的血漿葉酸受體抗體IgM結(jié)果均相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.944(P＜0.001)和0.779(P＜0.001)。

討 論

本研究以人葉酸受體蛋白作為包被蛋白，成功建立了人血漿葉酸受體抗體IgM濃度的ELISA檢測(cè)方法，該方法具有靈敏度高、精密度好、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。此外，本研究還對(duì)ELISA檢測(cè)人血漿葉酸受體自身抗體IgM濃度的方法進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。本研究采用的發(fā)光底物Femto，靶蛋白的檢測(cè)水平能達(dá)到飛克級(jí)，并且檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)樣品中靶蛋白濃度的測(cè)定值穩(wěn)定，因此該方法的檢測(cè)靈敏度高。此外，此方法檢測(cè)高、中、低3種不同濃度血漿葉酸受體抗體IgM濃度的批間和批內(nèi)差異均低于10%，對(duì)不同稀釋倍數(shù)同一樣本的測(cè)定結(jié)果的波動(dòng)均在可接受范圍內(nèi)，表明該方法有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。此方法采用化學(xué)發(fā)光法，與同位素標(biāo)記法相比，具有操作簡(jiǎn)單、試劑容易獲得、無放射性污染的優(yōu)點(diǎn)。此外，F(xiàn)emto底物達(dá)到最大信號(hào)的孵育時(shí)間僅為1 min，適合高通量檢測(cè)。因此，此方法適合實(shí)驗(yàn)室大樣本量檢測(cè)。

本研究分別采用人源葉酸受體蛋白和牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測(cè)板，檢測(cè)人血漿葉酸受體自身抗體含量，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果間有較好的相關(guān)性。牛源葉酸結(jié)合蛋白與人葉酸受體蛋白有80%的同源性，可以解釋檢測(cè)結(jié)果的高相關(guān)性。本研究用此方法分別檢測(cè)健康新生兒母親和神經(jīng)管畸形患兒母親的血漿葉酸受體自身抗體IgM濃度，健康新生兒母親血漿葉酸受體自身抗體IgM水平低，神經(jīng)管畸形患兒母親血漿葉酸受體自身抗體IgM水平高。結(jié)果顯示人源葉酸受體蛋白包板方法得到的測(cè)定值高于牛源葉酸結(jié)合蛋白包板方法，分別高出21%和69%，提示人源葉酸受體蛋白檢測(cè)葉酸受體抗體IgM更靈敏，更能反映人血漿樣本中葉酸受體自身抗體IgM的真實(shí)水平，如果用牛源葉酸結(jié)合蛋白包被檢測(cè)板可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室制備的混合血漿作為標(biāo)準(zhǔn)品，這是現(xiàn)階段的最佳選擇，目前尚無商業(yè)化的葉酸受體抗體標(biāo)準(zhǔn)品。本研究嘗試尋找更合適的葉酸受體抗體標(biāo)準(zhǔn)品，如來源于人類血清的IgM(#18260，美國(guó)Sigma公司)，由于此抗體為人混合血清，存在不同批次間差異的問題，所以相對(duì)于實(shí)驗(yàn)室制備的混合血漿，沒有明顯優(yōu)勢(shì);胎盤葉酸受體蛋白2抗體 (#bs-9595R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，由于此抗體僅有兔源產(chǎn)品，因此不適用于本研究。綜合經(jīng)費(fèi)以及質(zhì)量控制等因素，本研究選擇實(shí)驗(yàn)室制備的混合血漿作為標(biāo)準(zhǔn)品。

由于現(xiàn)階段缺乏制備葉酸受體抗體純品的技術(shù)，所以不能對(duì)葉酸受體抗體進(jìn)行絕對(duì)定量，但是對(duì)葉酸受體抗體的研究剛剛起步，相對(duì)定量值可以滿足目前本領(lǐng)域研究的需要，即進(jìn)行葉酸受體抗體與某些疾病如出生缺陷的關(guān)聯(lián)研究，將病例組與對(duì)照組進(jìn)行組間相對(duì)比較，尋求病因關(guān)系。

本研究的推廣可以促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品的研發(fā)，本研究建立了一種目前可以實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)血漿葉酸受體抗體的方法，旨在讓同領(lǐng)域研究者在此基礎(chǔ)上，研究葉酸受體抗體與相關(guān)疾病的關(guān)系。如果有重要意義的研究發(fā)現(xiàn)，如葉酸受體抗體與某些疾病 (如出生缺陷)有關(guān)聯(lián)，可以促進(jìn)研究者進(jìn)行葉酸受體抗體純品制備技術(shù)的開發(fā)。

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