楊根歡，吳 為，李硯川，倪 冷，王占啟，宋希濤，劉昌偉

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100730

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005

血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是體內(nèi)血紅素代謝的限速酶，它可以將血紅素代謝為膽紅素、一氧化氮及Fe2+。膽紅素在體內(nèi)具有強(qiáng)大的抗氧化作用，一氧化氮具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用，F(xiàn)e2+也是重要的抗氧化損傷的物質(zhì)［1］。因此HO-1在體內(nèi)具有重要的抗氧化損傷和細(xì)胞保護(hù)的作用，同時還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗凋亡等重要作用［2］。大量研究表明HO-1對機(jī)體的多個臟器均具有重要的保護(hù)功能，同時還與腫瘤有密切關(guān)系［3］。氧化損傷可由活性氧、氧自由基及超氧離子等引起，能夠氧化體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，給機(jī)體帶來巨大的損害［4］。有研究證實(shí)，氧化損傷能夠造成細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、細(xì)胞膜流動性異常、炎癥的產(chǎn)生及癌癥的發(fā)生等［5］。本研究構(gòu)建攜帶HO-1基因的慢病毒載體，同時篩選出能穩(wěn)定表達(dá)HO-1的單克隆細(xì)胞系并對其抗氧化損傷功能進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步研究HO-1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 改造的pLentiLox3.7質(zhì)粒、慢病毒輔助質(zhì)粒 (plp1、plp2、VSVG)，HEK293T細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。引物合成 (美國Invitrogen公司)，限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶 (英國NEB公司)，DNA聚合酶 (北京Transgene生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)uGENE HD轉(zhuǎn)染試劑 (瑞士Roche公司)，高糖-DMEM培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 (ScienCell公司)，Opti-MEM(美國Gibco公司)，胎牛血清 (美國Gibco公司)，鼠抗人HO-1抗體 (美國BD公司)，山羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋有限公司)，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧紅色熒光檢測試劑盒 (上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 根據(jù)Genebank人源HO-1基因的序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別加入酶切位點(diǎn)MluⅠ和BamHⅠ。引物序列如下:正向:5’-TAAGAATTCGCCACCATGGAGCGTCCGCAACC-3’;反向:5’-AATACGCGTCATGGCATAAAGCCCTACAGC-3’。PCR擴(kuò)增HO-1基因，目的基因模板由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 對PCR產(chǎn)物和改造的病毒空載體pLentiLox3.7(帶有標(biāo)記標(biāo)簽)行MluⅠ和BamHⅠ雙酶切。純化后于4℃過夜連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌，涂于LB平板后37℃孵育16 h。PCR鑒定3個陽性的克隆，并用3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western blot檢測 HEK293T中HO-1的表達(dá)。收集細(xì)胞并用SDS裂解液裂解細(xì)胞，充分震蕩至液體透明。將細(xì)胞裂解后的液體置于100℃中孵育10 min后，常溫下12 000 r/min(轉(zhuǎn)矩:3 100 Nm)離心10 min。BCA法測定蛋白濃度并計(jì)算上樣量。每孔上樣20 μg，140 V下10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min。330 mA下轉(zhuǎn)膜60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉。4℃下單克隆鼠抗HO-1(1∶4 000)抗體孵育過夜。洗膜3次后辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 (1∶8 000)室溫下孵育1 h，再次洗膜3次后顯影。

慢病毒的包裝和收集 將制備的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒 (plp1、plp2、VSVG)共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)?？偣?0 μg，二者之比為2∶1。將二者加入150 mmol/L的NaCl中，總體積為1 ml。取FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑20 μl加入150 mmol/L的NaCl中，總體積為1 ml，室溫靜置5 min。將稀釋的FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入質(zhì)粒的稀釋溶液中，輕輕混勻并室溫靜置20 min。將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴加入HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2的孵箱中。12 h后換液，24和48 h后收集培養(yǎng)基并置于4℃冰箱中保存。將收集的培養(yǎng)基用0.22 μm的濾器過濾，4℃離心機(jī)中18 000 r/min(轉(zhuǎn)矩:27 450 Nm)離心3 h。棄掉上清后用200 μl冷PBS重懸病毒，待溶解后置于－80℃冰箱中保存或直接用于感染細(xì)胞。

病毒感染HEK293T細(xì)胞及單克隆挑選 將HEK293T細(xì)胞從液氮中取出立即置于37℃溫水中，輕輕震蕩使其快速溶解。然后置于離心管中，室溫下2 000 r/min(轉(zhuǎn)矩:300 Nm)離心。棄掉上清后，加入新鮮培養(yǎng)基2 ml吹勻，將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中。12 h后細(xì)胞匯合80%時，分別加入5、10、20 μl病毒液感染。同時加入終濃度為5 μg/μl的聚凝胺輔助感染。感染72 h后于熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光，消化細(xì)胞并調(diào)節(jié)其終濃度為10個/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板行單克隆篩選，每周補(bǔ)液200 μl，4周后挑選帶熒光的單克隆進(jìn)行鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)。同時行Western blot檢測HO-1的表達(dá)。

加入過氧化氫的HEK293T及HUVEC內(nèi)活性氧的檢測 用二氫溴化乙啶 (dihydroethidium bromide;DHE)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量是基于DHE能夠完全自由通過細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)長期滯留而不外漏，一旦被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化即轉(zhuǎn)變?yōu)殇寤亦?，溴化乙啶進(jìn)入細(xì)胞核后與DNA緊密結(jié)合并產(chǎn)生紅色熒光。將穩(wěn)定表達(dá)HO-1及正常對照的HEK293T細(xì)胞傳代于6孔板中，其中實(shí)驗(yàn)組傳兩個孔，對照組傳4個孔。細(xì)胞鋪約80%時，將兩個孔的實(shí)驗(yàn)組和兩個孔的對照組加入終質(zhì)量濃度為0.5 mmol/L的過氧化氫，留兩孔正常HEK293T做空白對照。3 h后換液，加入稀釋的DHE(1∶1 000)，37℃孵育20 min。吸盡DHE后加入試劑盒中的保存液，置于熒光顯微鏡下觀察各組熒光強(qiáng)度并照相，熒光的強(qiáng)弱代表細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量即細(xì)胞被氧化的程度。同樣復(fù)蘇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞于6孔板中，分組同HEK293T。待細(xì)胞匯合至50%時，用攜帶HO-1的慢病毒感染實(shí)驗(yàn)組的兩個孔的細(xì)胞。72 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方法同HEK293T細(xì)胞，同時行Western blot檢測HUVEC中HO-1的表達(dá)情況。

結(jié) 果

重組質(zhì)粒的鑒定 將目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物和改造的病毒空載體pLentiLox3.7行MluⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化。挑取3個陽性克隆行PCR鑒定，結(jié)果顯示目的基因HO-1片段大小與預(yù)期的相符 (圖1)。用3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后置于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示綠色熒光明顯且轉(zhuǎn)染效率較高(圖2)。收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞行Western blot檢測HO-1的表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比HO-1(帶有標(biāo)記標(biāo)簽)表達(dá)明顯增高 (圖3)。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞Fig 2 The HEK293T cells transfected by the recombinant plasmid

圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞行Western blot檢測HO-1Fig 3 Detecting the HO-1 in the transfected HEK293T cells by Western blot

慢病毒包裝 將重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。24 h后置于熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光出現(xiàn)，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。48 h后熒光顯微鏡下觀察，熒光亮度強(qiáng)且表達(dá)率高，表明已成功包裝出病毒。

慢病毒感染HEK293T細(xì)胞 用包裝出的攜帶H0-1目的基因的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞并行單克隆篩選，熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)HO-1的細(xì)胞占總細(xì)胞的比例接近100%(圖4)。行Western blot檢測，結(jié)果顯示與對照組相比實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的HO-1表達(dá)明顯升高 (圖5)。

過表達(dá)HO-1抗細(xì)胞氧化損傷的作用 將過氧化氫分別加入過表達(dá)HO-1及正常對照的HEK293T細(xì)胞和HUVEC中，用DHE檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，結(jié)果顯示與正常對照組相比，加入過氧化氫的細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量明顯增多 (熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng))。而過表達(dá)HO-1后，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量明顯減低 (圖6)。

圖5 感染慢病毒的HEK293T/HUVEC行Western blot檢測HO-1Fig 5 Detecting the HO-1 in the infected HEK293T/HUVEC cells by Western blot

討 論

人體內(nèi)的血紅素加氧酶有3種不同的亞型，其中HO-1被稱為熱休克蛋白32，是誘導(dǎo)型的血紅素加氧酶。氧化損傷、炎癥刺激、缺血、缺氧、感染等均可誘導(dǎo)其表達(dá)［6］。在各種誘導(dǎo)因素的作用下，機(jī)體的心血管、肝臟、腎臟、肺等多個臟器均可表達(dá)HO-1［7］。大量研究表明HO-1與多種疾病密切相關(guān)，如炎癥相關(guān)性疾病 (感染、哮喘)、肺損傷 (肺氧化損傷、肺纖維化、呼吸機(jī)相關(guān)的肺損傷)、心血管疾病 (心肌梗死、高血壓、肺動脈高壓、動脈粥樣硬化)、缺血再灌注損傷、器官移植、腫瘤等［8］。

目前國內(nèi)外構(gòu)建的用于研究HO-1的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體［9-12］，各種載體均有其優(yōu)缺點(diǎn)。慢病毒載體可以有效地將外源基因整合到宿主的染色體上，并且能夠使之持久性地表達(dá)［13］。慢病毒載體不但能夠感染分裂期細(xì)胞而且還能夠感染非分裂期細(xì)胞，其感染細(xì)胞的種類范圍廣泛。同時慢病毒還具有能夠容納外源大片段基因、免疫反應(yīng)較小、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究基因調(diào)控及功能的常用載體［14］。本研究構(gòu)建的攜帶HO-1的慢病毒載體具有操作簡單、可重復(fù)性好、產(chǎn)毒量高、感染率高及表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過擴(kuò)增HO-1基因并將其與改造的病毒空載體pLentiLox3.7連接構(gòu)建出了攜帶HO-1目的基因的質(zhì)粒。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T并行Western blot檢測，其HO-1表達(dá)明顯升高，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將包裝出的病毒感染HEK293T并行Western blot檢測，其HO-1表達(dá)明顯升高，表明成功包裝出攜帶HO-1的有活力的慢病毒。同時本研究用包裝出的病毒感染HEK293T并篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)HO-1的細(xì)胞系，這解決了正常情況下HO-1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)低的難點(diǎn)。本研究對HO-1的功能進(jìn)行了初步探索，加入過氧化氫的HEK293T及HUVEC內(nèi)活性氧的含量較空白對照組明顯增多，表明過氧化氫對細(xì)胞具有明顯的氧化損傷作用。而加入過氧化氫后，過表達(dá)HO-1的HEK293T及HUVEC內(nèi)活性氧的含量較對照組明顯減少，表明HO-1具有明顯抗氧化損傷的作用。

綜上，本研究構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)人HO-1的細(xì)胞系，并對HO-1的抗氧化損傷作用進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步探索HO-1的功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖6 過氧化氫對HEK293T/HUVEC的氧化作用及HO-1的保護(hù)作用Fig6 Oxidative role of hydrogen peroxide on the HEK293T/HUVEC and the protective role of HO-1

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