張 曄， 劉湘寧， 李婷薇， 賴仁發(fā)

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510632)

頜骨在解剖形態(tài)和功能上有其特殊性，不但支撐著整個頜面部的美觀外形,而且支持著咀嚼功能。然而由外傷、腫瘤等造成頜骨缺損卻頻繁發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害了患者的面部美觀和咀嚼功能，對患者的生理和心理健康造成了嚴(yán)重創(chuàng)傷。同時對頜骨缺損美觀和功能的修復(fù)一直也是口腔醫(yī)生所面臨的難題之一。因此對頜骨缺損理想修復(fù)的研究一直是口腔界的熱點課題，骨組織工程應(yīng)運而生。一種理想的骨修復(fù)材料應(yīng)該具有良好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，能促進新骨的形成和生長，在新骨完成了結(jié)構(gòu)和功能重建后，植入物可以被完全爬行替代[1-2]。而對于頜骨修復(fù)來說，修復(fù)材料不僅需要有良好的誘導(dǎo)性和傳導(dǎo)性，還需要能夠根據(jù)骨缺損的形態(tài)進行塑形。有大量的實驗研究表明骨形成蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP-2)能夠誘導(dǎo)骨再生[3-4]。而異種松質(zhì)骨不僅能夠根據(jù)頜骨缺損的形態(tài)進行加工塑形，而且擁有天然骨的多孔結(jié)構(gòu)。彭磊等[5]的實驗表明松質(zhì)骨能為其它細(xì)胞、細(xì)胞因子的復(fù)合及新骨長入提供良好的環(huán)境，這一特性解決了化學(xué)合成人工骨空隙率和空隙交通孔徑太小的難題。目前在臨床上所使用的最為廣泛的異種骨產(chǎn)品主要為牛骨來源(以Bio-oss為代表)。其具備良好的骨傳導(dǎo)性，但缺乏骨誘導(dǎo)性，修復(fù)骨組織時間長達(dá)半年以上，且在修復(fù)大面積骨缺損時無法塑形。而且部分患者由于對朊病毒傳播疾病如牛海綿狀腦病(瘋牛病)的恐懼而難以接受移植牛骨來源的骨產(chǎn)品，所以現(xiàn)階段豬牛羊犬等的異種骨產(chǎn)品的開發(fā)利用已成為歐美國家生物材料研究的重點。本研究將重組人骨形成蛋白(recombinant human BMP-2, rhBMP-2)與去抗原松質(zhì)骨復(fù)合，植入兔下頜骨缺損處，探討其在修復(fù)骨缺損中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物及材料

28只6月齡新西蘭大白兔均為普通級,采用標(biāo)準(zhǔn)兔飼料喂養(yǎng),體重均約為2.5～3.0 kg，雌雄不限，健康，無系統(tǒng)性疾病。

異種去抗原松質(zhì)骨由廣東冠昊科技股份有限公司提供。松質(zhì)骨取自健康家豬髂骨。rhBMP-2由暨南大學(xué)生物工程研究所提供。

2 主要方法

2.1動物實驗 將28只兔按照完全隨機分組分為3組：異種去抗原松質(zhì)骨/rhBMP-2組(A組)、異種去抗原松質(zhì)骨組(B組)，每組12只；空白對照組(C組)4只。根據(jù)兔體重將3%戊巴比妥鈉按0.03 g/kg的注射量全麻。沿下頜骨下緣上5 mm處，由頦孔至下頜升支處，平行于下頜骨下緣做一2 cm長切口，暴露術(shù)區(qū)骨面。于術(shù)區(qū)下頜骨頦孔至下頜升支處做一15 mm×6 mm的全層缺損。根據(jù)分組分別于缺損區(qū)植入復(fù)合rhBMP-2的異種去抗原松質(zhì)骨、異種去抗原松質(zhì)骨及不植入任何骨替代品。植入的異種去抗原松質(zhì)骨規(guī)格為15 mm×6 mm×6 mm，縫合。術(shù)后連續(xù)3 d，每天2次肌注慶大霉素針4×104U，預(yù)防感染。

2.2X線檢查 將各標(biāo)本按照組別編號分別拍攝X線片，觀察組間、組內(nèi)不同時間骨缺損的愈合狀況。骨愈合X線片采用Lane-Sandhu法評分標(biāo)準(zhǔn)評分(表1)，并比較各組間各時點骨愈合的情況。

表1 Lane-Sandhu法X線攝片評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3雙能X線吸收法 (dual-energy X-ray absorp-tiometry, DXA)檢測骨密度 使用GE公司的 Lunar Prodigy骨密度儀分別檢測各組下頜骨術(shù)區(qū)的骨礦物質(zhì)密度，比較成骨的質(zhì)量和成骨速度。

2.4組織病理切片HE染色觀察 用齒科電鉆(生理鹽水局部沖洗降溫)于原植入材料與自體骨交界處外5 mm范圍內(nèi)截取骨標(biāo)本，經(jīng)脫鈣處理后從矢狀面制成5 μm切片。切片HE染色后，觀察植入物與周圍骨組織的結(jié)合、新生骨的生成和改建、去抗原異種松質(zhì)骨的降解吸收、新生骨在材料中的爬行替代過程及其它相關(guān)情況。

2.5新生骨定量分析 取各標(biāo)本的切片，在50倍光鏡視野下觀察新骨形成情況，取各切片5個部分圖像，4個角和缺損中部圖像，并將圖像采集收入Leica Qwin圖像分析軟件中，測量新生骨組織占測量框架的面積百分比，取平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以Levene法進行方差齊性檢驗，方差齊者以Bonferroni法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 標(biāo)本的大體觀察

術(shù)后第12周，取右側(cè)下頜骨標(biāo)本，未見移植物有脫落、移位、排出等。A組可見植入材料全部由骨痂覆蓋；B組可見植入材料頰舌側(cè)完全由骨痂覆蓋； C組可見缺損處未愈合,見圖1。

Figure 1. General observation in the 12th week. A: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone/rhBMP-2 group; B: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone group; C: blank control group.

2 X線檢查結(jié)果及影像學(xué)評分

術(shù)后第12周,A組植入材料與自體骨邊界完全消失，植入的異種去抗原松質(zhì)骨原骨小梁結(jié)構(gòu)消失，材料已完全降解，已形成與正常自體骨結(jié)構(gòu)相似，密度相近的骨組織；B組材料邊緣與自體骨部分融合，植入的異種去抗原松質(zhì)骨骨小梁部分可見，接近正常自體骨組織；C組可見缺損中間仍有約10 mm×6 mm大小的低密度影，缺損邊緣呈云霧狀，見圖2。

Figure 2. X-ray test in the 12th week.A: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone/rhBMP-2 group; B: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone group; C: blank control group.

A組與B組各時點影像學(xué)評分比較， 8周及12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A組與C組12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義；B組與C組12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 影像學(xué)評分

3 骨密度測量結(jié)果

A組與B組各時點骨密度值比較，12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義,B組比A組骨密度要低；A組與C組12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義；B組與C組12周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 骨密度值

4 組織學(xué)觀察

術(shù)后第4周，A組植入材料骨小梁部分降解，大量片狀新生骨形成并向植入骨區(qū)爬行，新生骨周可見大量的成骨細(xì)胞。B組植入材料邊緣可見纖維組織、毛細(xì)血管增生；可見少量新骨生成，呈不連續(xù)條索狀，向植入骨區(qū)爬行；新骨周可見成骨細(xì)胞圍繞，見圖3。術(shù)后第8周：A組植入材料骨小梁大量降解，大量新生骨形成，片狀，向植入骨區(qū)爬行，新生骨周仍可見大量的成骨細(xì)胞。B組植入材料骨小梁部分降解，較多新生骨形成，條索狀，不連續(xù)，向植入骨區(qū)爬行；新生骨周可見大量的成骨細(xì)胞，見圖4。術(shù)后第12周：A組植入材料骨小梁大部分降解，大量新生骨形成，片狀，可見大量成熟的骨小梁，新生骨周仍可見大量的成骨細(xì)胞。B組植入材料骨小梁部分降解較多新生骨形成，條索狀，不連續(xù)，向植入骨區(qū)爬行，可見部分成熟的骨小梁；新生骨周可見大量的成骨細(xì)胞。C組：可見缺損區(qū)未愈合，缺損處邊緣主要由肉芽組織充填，見圖5。

5 新生骨面積百分比

A組與B組新生骨面積百分比各時點比較，4周組、8周組及12周組各時點2組的新生骨面積百分比差別有統(tǒng)計學(xué)意義；A組與C組新生骨面積百分比比較，12周時2組的新生骨面積百分比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組新生骨面積百分比比較，12周時2組的新生骨面積百分比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

Figure 3. Hematoxylin and eosin staining in the 4th week(×100).A: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone/rhBMP-2 group; B: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone group.

Figure 4. Hematoxylin and eosin staining in the 8th week (×100).A: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone/rhBMP-2 group; B: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone group.

Figure 5. Hematoxylin and eosin staining in the 12th week. A: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone/rhBMP-2 group (×100); B: antigen-extracted xenogeneic cancellous bone group (×100); C: blank control group(×50).

表4 新生骨面積百分比

討 論

臨床工作中，患者由腫瘤、外傷、先天畸形等所引起的口腔頜面部的大面積骨骼缺損，由于頜面部解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，大大增加了臨床骨缺損修復(fù)的難度。在臨床工作和基礎(chǔ)研究中，發(fā)展了針對大面積骨缺損修復(fù)的多元化治療策略，即將醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)及工程學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用于骨組織工程，培育有成骨活性的組織，挖掘機體自身儲存的修復(fù)潛力，修復(fù)及重建頜骨缺損區(qū)的結(jié)構(gòu)，維持及改善其功能[6]。組織工程骨的出現(xiàn)使得大面積骨缺損的修復(fù)具備了更多的可能性。在本實驗中，動物的下頜骨缺損選擇15 mm×6 mm。12周后，空白對照組無法完全愈合，表明兔無法在短期內(nèi)自行修復(fù)缺損。

骨組織工程有3個關(guān)鍵要素,分別為種子細(xì)胞、支架材料、生長因子[7]。本實驗采用的去抗原異種骨+rhBMP-2是其建造原理之一：支架材料+生長因子。

骨組織工程的核心在于構(gòu)建細(xì)胞或生長因子生物支架材料復(fù)合體。有研究表明骨形成所需的最小孔徑至少為100 μm，理想的適合骨生長的孔徑為300～500 μm[8]。本實驗所采用的異種骨為豬的松質(zhì)骨(髂骨)，經(jīng)過相關(guān)的去抗原處理后保留了原有的骨骼組織結(jié)構(gòu)。雷榮昌等[9]對豬松質(zhì)骨(髂骨)支架結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)豬松質(zhì)骨支架孔徑為(387.54±21.60) μm，孔隙率為78.26%±2.01%；最大抗壓強度和抗壓力分別為25 MPa和12 N。這說明松質(zhì)骨保留了天然骨組織良好的孔隙率和孔隙交通，為生長因子的吸附以及成骨細(xì)胞的生長、分化提供良好的支架。實驗中，X線片和HE染色均顯示異種去抗原松質(zhì)骨組的植入材料骨組織逐漸降解吸收而被新骨替代,但HE染色顯示植入骨中間區(qū)域無明顯新骨形成, 說明骨替代從兩側(cè)向中間進行。所以本實驗所使用異種去抗原松質(zhì)骨具有良好的骨傳導(dǎo)性并且能夠被降解吸收，無骨誘導(dǎo)性。

生長因子是組織工程骨的另一關(guān)鍵要素。BMP是已知的骨生長因子中對骨的形成作用最強的生長因子，對骨組織的形成、骨組織的生長、骨組織的鈣化礦化及骨損傷修復(fù)均有促進作用[10]。Matsumoto等[11]的研究表明BMP-2可發(fā)揮起骨誘導(dǎo)作用，修復(fù)大面積的骨缺損。大量的實驗研究也表明BMP具有良好的骨誘導(dǎo)性[12-13]。本實驗應(yīng)用的rhBMP-2是由暨南大學(xué)生物工程研究所利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)純化復(fù)性的產(chǎn)物，活性檢測實驗顯示，它具有良好的骨誘導(dǎo)活性[14]。實驗中，從X線片可發(fā)現(xiàn)，異種去抗原松質(zhì)骨/rhBMP-2組比異種去抗原松質(zhì)骨組更快完成了骨替代，同時在HE病理切片中也證實了這一點。經(jīng)統(tǒng)計分析，12周時異種去抗原松質(zhì)骨組和異種去抗原松質(zhì)骨/rhBMP-2組之間的成骨效能存在顯著差異，異種去抗原松質(zhì)骨/rhBMP-2組具備更好的成骨效能。這與rhBMP-2的骨誘導(dǎo)作用密切相關(guān)。隨著時間的增長， HE染色鏡下見各時點均存在新骨生成，及大量的新生血管、成骨細(xì)胞，表明rhBMP-2能持續(xù)發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用?？傊?，rhBMP-2能夠吸附在異種去抗原松質(zhì)骨支架中發(fā)揮穩(wěn)定的骨誘導(dǎo)作用。

綜上所述，異種去抗原松質(zhì)骨能夠作為骨傳導(dǎo)支架,能很好地吸附rhBMP-2，是rhBMP-2良好的載體；異種去抗原松質(zhì)骨/rhBMP-2復(fù)合材料能起到持續(xù)成骨的作用，加速了骨缺損修復(fù)速度，是一種較好的組織工程骨修復(fù)材料。

[參 考 文 獻]

[1] Finkemeier CG. Bone-grafting and bone-graft substitutes[J]. J Bone Joint Surg Am, 2002, 84(3):454-464.

[2] Toms AD, Barker RL, Jones RS, et al. Impaction bone-grafting in revision joint replacement surgery [J]. J Bone Joint Surg Am, 2004,86(9):2050-2060.

[3] Issa JP, Nascimento C, Iyomasa MM, et al. Bone healing process in critical-sized defects by rhBMP-2 using poloxamer gel and collagen sponge as carriers[J].Micron,2008,39(1):17-24.

[4] Steinhardt Y, Aslan H, Regev E, et al. Maxillofacial-derived stem cells regenerate critical mandibular bone defect[J]. Tissue Eng Part A, 2008,14(11):1763-1773.

[5] 彭 磊, 胡蘊玉, 薛恩興, 等.成骨細(xì)胞復(fù)合去抗原異種松質(zhì)骨再造骨組織的實驗研究[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,36(1):16-19.

[6] Drosse I，Volkmer E，Capanna R，et al． Tissue engineering for bone defect healing: an update on a multi-component approach [J]． Injury,2008,39(Suppl 2)：S9-S20．

[7] 楊維東, 毛天球.口腔頜面骨替代材料與骨組織工程[J].實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,15(6):469-471.

[8] Kuhne JH, Bartl R, Frisch B, et al. Bone formation in coralline hydroxyapatite. Effects of pore size studied in rabbits[J]. Acta Orthop Scand, 1994,65(3):246-252.

[9] 雷榮昌,翦新春.松質(zhì)骨支架的制備及結(jié)構(gòu)特征觀察 [J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床,2006,10(3):128-130.

[10] Yu LM, Wang ZL. Advances of bone morphogenetic protein 2 induced ectopic bone formation in skeletal muscle [J]. J Oral Maxillofac Surg,2008, 18(4):300-303.

[11] Matsumoto G, Omi Y, Kubota E, et al. Enhanced regeneration of critical bone defects using a biodegradable gelatin sponge and beta-tricalcium phosphate with bone morphogenetic protein-2[J]. J Biomater Appl, 2009,24(4):327-342.

[12] Shin JH, Kim KH, Kim SH, et al.Exvivobone morphogenetic protein-2 gene delivery using gingival fibroblasts promotes bone regeneration in rats[J]. J Clin Periodontol, 2010,37(3):305-311.

[13] Ben-David D, Srouji S, Shapira-Schweitzer K, et al. Low dose BMP-2 treatment for bone repair using a PEGylated fibrinogen hydrogel matrix[J]. Biomaterials, 2013, 34(12):2902-2910.

[14] Sun F, Wang J, Sun J, et al. Expression, purification and refolding of recombinant human bone morphogenetic protein-2 inEscherichiacoli[J].Chin J Pathophysiol(中國病理生理雜志), 2005,21 (8):1480-1485.