豐茂曉， 朱容萱， 駱小闖， 古春明， 曾 雪， 費(fèi) 嘉△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)與分子生物學(xué)系, 2臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是惡性漿細(xì)胞克隆性增殖疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括染色體數(shù)量異常、易位、基因突變、表觀遺傳學(xué)改變以及骨髓微環(huán)境的改變[1]。多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病呈現(xiàn)多步驟的過(guò)程，早期的染色體易位涉及到14號(hào)染色體(14q32.33)和4號(hào)染色體(4p16.3)，結(jié)果導(dǎo)致4號(hào)染色體上相鄰的多發(fā)性骨髓瘤組蛋白(multiple myeloma SET protein，MMSET)基因和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fibroblast growth factor receptors 3，F(xiàn)GFR3)基因發(fā)生分離[2]。隨著疾病的發(fā)展，將再次發(fā)生染色體易位、相關(guān)基因的突變(涉及到K-RAS和N-RAS的激活)、復(fù)雜核型畸變、p53和FGFR3基因的突變以及細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制劑2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)和細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制劑2C(cyclin-dependent kinase inhibitor 2C,CDKN2C)基因的失活[2]。這些遺傳畸變將導(dǎo)致惡性漿細(xì)胞黏附分子表達(dá)的改變，必然引起漿細(xì)胞和骨髓基質(zhì)的異常作用[2]，進(jìn)而引起人骨髓微環(huán)境(human bone marrow microenvironment, huBMM)中的漿細(xì)胞發(fā)生多級(jí)轉(zhuǎn)變，這些轉(zhuǎn)變對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和耐藥性有著重要的影響[3-5]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞中的miRNAs呈顯著的異常表達(dá)，并認(rèn)為這些異常表達(dá)的miRNAs與漿細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)畸變，特別是與染色體異常有密切的關(guān)聯(lián)[2,6-7]。

Al Masri等[8]的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞系和病人的骨髓樣本中，惡性的漿細(xì)胞miRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的差異，其中高表達(dá)的miRNAs包括miR-125b、miR-133a、miR-1和miR-124a。Bakkus等[9]也檢測(cè)出MM病人以及細(xì)胞系中一些高表達(dá)的miRNAs(let-7a、miR-16、miR-17-5p和miR-19b)。Picchiorri等[10]還發(fā)現(xiàn)，miRNA-17～92群(miRNA-19a、-19b和-92)和miRNA-106～25 群(miRNA-106b、-93和-25)在MM樣品中也呈現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象，miRNA-17～92通過(guò)靶向負(fù)性調(diào)節(jié)凋亡前體蛋白Bim的表達(dá)，有助于骨髓瘤的形成。Lane等[11]對(duì)MM樣品中異常表達(dá)的miRNA 進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miR-19a和miR-19b表達(dá)水平升高，并揭示這些miRNAs參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)和白細(xì)胞介素 6(interleukin-6, IL-6)的抗凋亡途徑。根據(jù)染色體易位和周期蛋白D (translocation/cyclin D, TC)分類(lèi)，Lionetti等[6]通過(guò)多重分析發(fā)現(xiàn)MM在5個(gè)TC組中有26個(gè)miRNAs具有顯著表達(dá)差異現(xiàn)象，其中值得注意的是在TC5組中有10種miRNAs相比于其它4個(gè)TC組有明顯的過(guò)表達(dá)趨勢(shì)。在這10種過(guò)表達(dá)的miRNAs中，miR-155在MM中高水平表達(dá)首次被發(fā)現(xiàn)。 目前已知miR-155在B細(xì)胞淋巴瘤中是一個(gè)重要的生物標(biāo)志物，有關(guān)miR-155在惡性漿細(xì)胞病中的功能還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。由于漿細(xì)胞也是來(lái)源于B細(xì)胞，因此，miR-155在MM中是否具有類(lèi)似B細(xì)胞淋巴瘤中癌基因功能，這引起我們極大的關(guān)注。

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性，約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼小RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控機(jī)制在細(xì)胞過(guò)程中起著重要的作用。成熟的miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’UTR)配對(duì)，從而抑制翻譯過(guò)程或降解靶mRNA。這些小分子RNA也可能在腫瘤形成過(guò)程中起重要作用[12]，類(lèi)似癌基因(oncomiRs)功能，因此oncomiRs被當(dāng)作為癌癥治療新的靶點(diǎn)[13]。另一方面，在miRNA的5’端具有7～8個(gè)高度保守序列，被稱(chēng)為種子序列。種子序列通過(guò)與其靶基因mRNA的3’UTR進(jìn)行堿基完全互補(bǔ)配對(duì)，促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而對(duì)靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)性調(diào)控[14-16]。針對(duì)miRNA種子序列反義核酸可以干擾miRNA與靶基因的配對(duì)，從而阻止miRNA發(fā)揮功能。相對(duì)于成熟miRNA而言，針對(duì)種子序列的反義核酸具有分子量小、特異性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，因而開(kāi)始受到關(guān)注[17]。

為了闡述miR-155在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的作用，本研究針對(duì)miR-155的種子序列合成miR-155的微小反義核酸(tiny antimiR-155, t-antimiR-155)，靶向作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI-8266中的miR-155，探究t-antimiR-155對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時(shí)也為針對(duì)miRNA種子序列的反義核酸藥物開(kāi)發(fā)創(chuàng)造有利條件。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成

從microRNA Families數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人miR-155的種子序列，根據(jù)序列互補(bǔ)原理設(shè)計(jì)針對(duì)種子序列的反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核苷酸序列及隨機(jī)對(duì)照序列，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The sequences of miR-155 and t-antimiR-155.

2 主要試劑

MTT和DMSO購(gòu)自Sigma；胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen。反義寡核苷酸序列(t-antimiR-155)：5’-AGCATTAA-3’；隨機(jī)序列(scrambled sequence，SCR)：5’-TCATACTA-3’，均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修飾，高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)純化。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將RPMI-8266細(xì)胞(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院惠贈(zèng))接種于含10%胎牛血清、無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2～3 d換液傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、0.2%臺(tái)盼藍(lán)拒染率>95%的細(xì)胞。

3.2MTT法篩選反義寡核苷酸的最佳作用濃度 本實(shí)驗(yàn)分t-antimiR-155組、SCR組和空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。t-antimiR-155組中t-antimiR-155的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4 和0.5 μmol/L，SCR組中隨機(jī)序列的核酸終濃度為0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI-8266細(xì)胞，各組細(xì)胞以1×108cells/L的密度接種于96孔板，每孔50 μL，轉(zhuǎn)染終體積100 μL(轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū))，空白對(duì)照組加入50 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6 h后，每孔加入100 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，使每孔終體積為200 μL。48 h后每孔加入MTT液20 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度A570。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

3.3甲基纖維素細(xì)胞集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞集落形成情況 實(shí)驗(yàn)分組同前，根據(jù)文獻(xiàn)改進(jìn)[11]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI-8266細(xì)胞，按1×103cells/well接種于含20%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5 μmol/L β-疏基乙醇和0.9%甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)7 d。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)和觀察集落形態(tài)，以大于40個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)集落。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算相對(duì)集落形成率=(實(shí)驗(yàn)組/空白對(duì)照組)×100%。

3.4流式細(xì)胞儀計(jì)量分析RPMI-8266細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)分組同前，各組細(xì)胞以5×107cells/L的密度接種于24孔板，每孔400 μL，轉(zhuǎn)染終體積500 μL，空白對(duì)照組加入與實(shí)驗(yàn)組同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。6 h后加入500 μL 含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反義寡核苷酸組和隨機(jī)對(duì)照組的核酸終濃度為0.4 μmol/L。48 h后離心收集細(xì)胞，采用Annexin V/PI二重染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析法(one-way AVONA)分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法篩選反義寡核苷酸最佳作用濃度

t-antimiR-155在0.2 μmol/L和0.4 μmol/L之間有效抑制RPMI-8266細(xì)胞增殖活性，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L，與SCR組相比差異顯著(P<0.05)。t-antimiR-155在0.5 μmol/L的濃度顯示出非特異性作用，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Inhibition rate of RPMI-8266 cells after transfected with t-antimiR-155.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR group.

2 反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞集落形成的影響

采用甲基纖維素為支持物的集落形成法(colony forming method)檢測(cè)RPMI-8266細(xì)胞的自我更新和增殖能力。7 d后，與SCR組相比，0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細(xì)胞后，細(xì)胞集落形成能力較弱,集落形成抑制率較高，差異顯著(P<0.05),見(jiàn)圖3。

3 反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

0.4 μmol/L反義寡核苷酸作用于RPMI-8266細(xì)胞48 h后，經(jīng)Annexin V/PI二重染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率為7.56%。與SCR組相比，其凋亡率明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明t-antimiR-155作用于RPMI-8266細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加。

Figure 3. Cell colony formation assay of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

Figure 4. Flow cytometry analysis of the apoptosis of RPMI-8266 cells.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs SCR.

討 論

多發(fā)性骨髓瘤是起源于漿細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，以血清或尿液中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白以及多器官功能損害為特征，約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%。常規(guī)化療緩解率低，迄今難以治愈[18-19]，因此，需要尋找新的治療手段。

miR-155位于21號(hào)染色體上，參與人體造血、炎癥和免疫等功能[6]。作為一個(gè)類(lèi)似癌基因， miR-155在多個(gè)腫瘤中高水平表達(dá)[20]，與白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌的形成過(guò)程都有密切的關(guān)系[21]。在華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom macroglobulinemia，WM)中，失調(diào)的miR-155通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt和核因子κB信號(hào)通路，影響WM細(xì)胞生存和生長(zhǎng)[22]；通過(guò)敲除miR-155，導(dǎo)致位于G1期的WM細(xì)胞明顯降低，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞周期依賴(lài)激酶和細(xì)胞周期蛋白D下調(diào)并刺激p53蛋白過(guò)表達(dá)。這意味著miR-155在WM細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白導(dǎo)致G1期阻滯[22]。雖然WM和MM一樣，也是漿細(xì)胞病的一種，但miR-155在MM中確切的功能還不清楚。

基于文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-155在MM中的高水平表達(dá)[6]，可能具有類(lèi)似癌基因的作用，本研究針對(duì)miR-155的種子序列合成反義寡核苷酸t(yī)-antimiR-155，研究其在多發(fā)性骨髓瘤中的抑制作用。我們的數(shù)據(jù)顯示t-antimiR-155經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，顯著抑制RPMI-8266細(xì)胞的增殖，其最佳作用濃度為0.4 μmol/L(圖2)。其他的研究揭示乳腺癌中miR-155靶基因編碼的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a(forkhead box O3a)，涉及細(xì)胞的存活[23]。同時(shí)，Linnstaedt等[24]也證實(shí)在大細(xì)胞淋巴瘤和彌散性大B細(xì)胞淋巴性淋巴瘤中，抑制miR-155的水平也可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，與我們的結(jié)果一致。本研究首次采用了克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)研究t-antimiR-155對(duì)RPMI-8266細(xì)胞惡性程度的影響，數(shù)據(jù)顯示t-antimiR-155可以降低RPMI-8266細(xì)胞集落形成的能力(圖3)，有效抑制RPMI-8266細(xì)胞的惡性進(jìn)展。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示t-antimiR-155可以明顯促進(jìn)RPMI-8266細(xì)胞的凋亡(圖4)。

在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)于mRNA的反義核苷酸已經(jīng)被廣泛用于評(píng)價(jià)靶基因的功能[25]，同時(shí)有些反義核酸治療方法已經(jīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)[25-26]，反義核苷酸藥物具有安全性高、易合成、直接抑制靶基因表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。miRNA反義核苷酸也是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，化學(xué)或生物合成與特定的miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、miRNA前體或成熟的miRNA互補(bǔ)的DNA或RNA序列。在細(xì)胞中miRNA反義DNA與靶miRNA形成miRNA-DNA雜化鏈，激活RNA酶H，引起miRNA的降解，從而達(dá)到基因控制和治療的目的。由于成熟miRNA只有19～24個(gè)核苷酸，目前認(rèn)為用反義核苷酸抑制它們的功能是最好、也可能是唯一的方法[27]。

反義核苷酸技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些不容忽視的問(wèn)題，比如高濃度藥物也有一定的毒副作用，與靶序列的親和力低，特別是藥物在體內(nèi)易被降解以及向靶器官傳遞效果不佳等制約了反義藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)程等。對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行一系列的化學(xué)修飾，可以增加反義寡核苷酸的親和力，提高其抗性和在體內(nèi)的輸送效率。提高反義寡核苷酸與靶RNA親和力的修飾涉及糖環(huán)部分，常用的修飾方法有鎖核苷酸(locked nucleic acid, LNA)修飾、2′-O-甲基(2′-O-methyl)修飾、2′-O-甲氧乙基(2′-O-methoxyethyl)修飾、2′-氟代(2′-fluoro)修飾，而在這些修飾中提升與互補(bǔ)RNA親和性最佳的為L(zhǎng)NA修飾，可使雙聯(lián)熔解溫度(Tm)上升2～8 ℃[28]。另一方面，通過(guò)對(duì)反義寡核苷酸骨架的硫代修飾和嗎啉代修飾，可以提高反義寡核苷酸抗性和體內(nèi)的輸送效率[28]。我們?cè)O(shè)計(jì)合成的miR-155種子序列的反義寡核苷酸進(jìn)行了全硫代修飾，本文中缺少對(duì)miR-155沉默的直接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這是本文章的不足之處，將作為我們今后進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

目前，有關(guān)于miR-155的反義寡核苷酸經(jīng)過(guò)LNA修飾可以沉默miR-155的報(bào)道。他們選用miR-155的多個(gè)靶基因做成熒光報(bào)告基因，用來(lái)檢測(cè)miR-155是否被沉默。檢測(cè)的結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)LNA修飾的antimiR-155可以使miR-155的多個(gè)靶基因(SOCS1、SMAD5、CEBPβ、MAFB、SHANK2和SH3PXD2A)的表達(dá)量明顯增加[29]。由于全硫代修飾的t-antimiR-155的序列和t-LNA-155的序列相同，從理論上看，他們的生物學(xué)功能應(yīng)當(dāng)是相似的。

我們雖然沒(méi)有通過(guò)檢測(cè)miR-155的靶基因來(lái)獲得全硫代修飾的t-antimiR-155沉默miR-155的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但在我們以前的研究中，將miR-21的靶基因程序性細(xì)胞死亡4(programmed cell death 4,PDCD4)做成熒光報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染硫代修飾的anti-miR-21后，PDCD4的熒光活力明顯比SCR和空白組要高[30]。此結(jié)果可以證明經(jīng)過(guò)全硫代修飾的反義寡核苷酸同樣也可以使靶miRNA沉默。

本研究顯示miR-155在多發(fā)性骨髓瘤中具有重要的類(lèi)似癌基因的作用，針對(duì)種子序列的t-antimiR-155顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展，可用于腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療研究，有一定的藥物開(kāi)發(fā)前景。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Raab MS, Podar K, Breitkreutz I, et al. Multiple myeloma[J]. Lancet, 2009,374(9686):324-339.

[2] Benetatos L, Vartholomatos G. Deregulated microRNAs in multiple myeloma[J]. Cancer, 2012, 118(4): 878-887.

[3] Tassone P, Tagliaferri P, Rossi M, et al. Genetics and molecular profiling of multiple myeloma: novel tools for clinical management?[J]. Eur J Cancer, 2006, 42(11): 1530-1538.

[4] Palumbo A, Anderson K. Multiple myeloma[J]. N Engl J Med, 2011, 364(11): 1046-1060.

[5] Tassone P, Tagliaferri P, Teresa Fulciniti M, et al. Novel therapeutic approaches based on the targeting of microenvironment-derived survival pathways in human cancer: experimental models and translational issues[J]. Curr Pharm Des, 2007, 13(5): 487-496.

[6] Lionetti M, Biasiolo M, Agnelli L, et al. Identification of micro-RNA expression patterns and definition of a microRNA/mRNA regulatory network in distinct molecular groups of multiple myeloma[J]. Blood, 2009, 114(25): e20-e26.

[7] Lionetti M, Agnelli L, Lombardi L, et al. MicroRNAs in the pathobiology of multiple myeloma[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2012, 12(7): 823-837.

[8] Al Masri A, Price-Troska T, Chesi M, et al. MicroRNA expression analysis in multiple myeloma [J]. Blood, 2005, 106(11):1554.

[9] Bakkus M, Dujardin S, Van Riet I, et al. MicroRNA expression analysis in multiple myeloma plasma cells and cell lines by a quantitative real-time PCR approach[J]. Blood, 2007, 110(11): 2472.

[10] Pichiorri F, Suh SS, Ladetto M, et al. MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(35): 12885-12890.

[11] Lane SW, Scadden DT, Gilliland DG. The leukemic stem cell niche: current concepts and therapeutic opportunities[J]. Blood, 2009, 114(6): 1150-1157.

[12] Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9): 2999-3004.

[13] Garzon R, Marcucci G, Croce CM. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges[J]. Nat Rev Drug Discov, 2010, 9(10): 775-789.

[14] Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009, 136(2): 215-233.

[15] Guo H, Ingolia NT, Weissman JS, et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J]. Nature, 2010, 466(7308):835-840．

[16] Djuranovic S, Nahvi A, Green R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay[J]. Science, 2012, 336(6078): 237-240.

[17] Obad S, dos Santos CO, Petri A, et al. Silencing of microRNA families by seed-targeting tiny LNAs[J]. Nat Genet, 2011, 43(4): 371-378.

[18] 夏 盈，鄭 冬，張瓏涓，等. 重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2013，29(5)：826-832.

[19] 馬泳泳，周淑娟，葛杭萍，等. 丙戊酸對(duì)RPMI8226和U266細(xì)胞增殖及IL-6/JAK/STAT信號(hào)通路的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2013，29(5)：833-838.

[20] Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs: microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer,2006,6(4): 259-269.

[21] Tili E, Michaille JJ, Adair B, et al. Resveratrol decreases the levels of miR-155 by upregulating miR-663, a microRNA targeting JunB and JunD[J]. Carcinogenesis, 2010, 31(9): 1561-1566.

[22] Roccaro AM, Sacco A, Chen C, et al. microRNA expression in the biology, prognosis, and therapy of Waldenstrom macroglobulinemia[J]. Blood, 2009,113(18): 4391-4402.

[23] Kong W, He L, Coppola M, et al. MicroRNA-155 regulates cell survival, growth, and chemosensitivity by targeting FOXO3a in breast cancer[J]. J Biol Chem, 2010, 285(23): 17869-17879.

[24] Linnstaedt SD, Gottwein E, Skalsky RL, et al. Virally induced cellular microRNA miR-155 plays a key role in B-cell immortalization by Epstein-Barr virus[J]. J Virol, 2010, 84(22): 11670-11678.

[25] Lee Y, Vassilakos A, Feng N, et al. GTI-2501, an antisense agent targeting R1, the large subunit of human ribonucleotide reductase, shows potent anti-tumor activity against a variety of tumors[J]. Int J Oncol, 2006, 28(2): 469-478.

[26] Chi KN, Eisenhauer E, Fazli L, et al. A phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of OGX-011, a 2′-methoxyethyl antisense oligonucleotide to clusterin, in patients with localized prostate cancer[J]. J Natl Canxer Inst, 2005, 97(17): 1287-1296.

[27] Esau CC. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides[J]. Methods, 2008, 44(1): 55-60.

[28] Stenvang J, Petri A, Lindow M, et al. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides[J]. Silence, 2012, 3: 1.

[29] Zhang Y, Roccaro AM, Rombaoa C, et al. LNA-mediated anti-miR-155 silencing in low-grade B-cell lymphomas[J]. Blood, 2012, 120(8): 1678-1686.

[30] Li Y, Zhu X, Gu J, et al. Anti-miR-21 oligonucleotide enhances chemosensitivity of leukemic HL60 cells to arabinosylcytosine by inducing apoptosis[J]. Hematology, 2010, 15(4): 215-221.