鄧學田，齊文秀，鍋紅芬

論著·基礎

p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表達與胃癌相關性 及聯(lián)合診斷價值分析

鄧學田，齊文秀，鍋紅芬

目的分析p14ARF、mdm2、p53基因異常表達與胃癌相關性以及聯(lián)合評定價值。方法基于S-P法(免疫組織化學染色法)檢測18例正常胃黏膜組織(健康對照組)、24例胃黏膜增生組織(增生組)、50例胃黏膜癌變組織(癌變組)標本中p14ARF、mdm2、p53基因表達水平，分析其與胃癌的相關性及用于診斷胃癌的準確度、敏感度、特異度。結果癌變組、增生組、健康對照組p14ARF(88.0%、75.0%、22.2%)、mdm2(88.0%、70.8%、27.8%)、p53表達(48.0%、41.7%、11.1%)陽性率均呈下降趨勢(P均<0.05)；三者表達與淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關(P<0.05)；p14ARF、mdm2、p53聯(lián)合用于胃癌診斷的準確度為93.4%，敏感度為96.0%，特異度為95.2%，均顯著高于三者單獨診斷的性能。結論p14ARF、mdm2、p53基因異常表達與胃癌發(fā)病和病情發(fā)展密切關聯(lián)，聯(lián)合檢測三者的表達水平對胃癌的診斷及病情評定具較高臨床價值。

p14ARF;mdm2;p53;胃癌;診斷價值

胃癌是高發(fā)性惡性腫瘤疾病之一，早期發(fā)病無明顯癥狀，容易造成漏診而耽誤最佳治療時機，晚期胃癌患者經(jīng)常規(guī)術后5年內(nèi)的存活率較低，其中完全切除術為31.3%，姑息切除術為11.7%。因此，尋找診斷胃癌的特異敏感性指標，成為有效治療胃癌的關鍵。以往研究認為[1]，組織癌變是由多種因素共同作用的結果，其中控癌基因的變異、缺失、擴增起著非常關鍵的作用。而對基因異常因素導致胃癌的研究較少，本研究就p14ARF、mdm2、p53基因異常表達與胃癌相關性及聯(lián)合診斷價值進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1—12月我院外科收治的胃癌患者50例，經(jīng)病理檢查確診，取其病理標本為癌變組，其中男27例，女23例，年齡32～68(48.6±11.4)歲；組織學分類：黏液腺癌6例，其他腺癌44例；TNM分期：I、II期32例，III、IV期18例；分化程度：低度分化27例，中度分化16例，高度分化7例；有無淋巴轉(zhuǎn)移：有淋巴轉(zhuǎn)移33例，無淋巴轉(zhuǎn)移17例。另選取本院病理科保存的24例胃黏膜非典型增生組織標本為增生組，男16例，女8例，年齡34～70(45.7±12.1)歲；選取于我院體檢的18例健康人正常胃黏膜組織作為健康對照組，男10例，女8例，年齡33～71(46.3±13.2)歲。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 主要試劑 S-P試劑盒[2]、DAB顯色試劑盒、兔抗人p14ARFmAb (單克隆抗體)、鼠抗人mdm2 mAb，鼠抗人p53 mAb等均購自北京西雅金橋生物技術有限公司，p14ARF、mdm2、p53三種基因蛋白陰性和陽性標本對照購自天津百浩生物科技有限公司。

1.3 檢測方法 將研究室已有的石蠟包埋切片(厚度為4 μm[3])，基于免疫組織化學染色原理測定p14ARF、mdm2、p53三種基因蛋白表達水平[4]。取切片，常規(guī)使用二甲苯、乙醇、PBS沖洗液進行切片脫蠟；切片放入檸檬鹽加熱，于90℃環(huán)境維持15 min后室溫冷卻修復抗原；PBS洗脫后，H2O2下孵化再洗脫；去PBS，加一抗，放置低溫(4℃)過夜；PBS洗脫，去洗液，加試劑A(聚合物增加劑)，放置體溫環(huán)境20 min,洗脫；去洗液，加試劑B(酶標鼠/兔抗聚合物)，放置體溫環(huán)境30 min,洗脫；去洗液，加新配制DAB，高倍鏡下觀察；自來水清洗，蘇木素染色，酒精分化；滴加不同濃度酒精，二甲苯，封片，制成標本。觀察時，各自取3種蛋白的陰性和陽性標本做檢測結果對照[5]。

1.4 評定方法 按照染色程度得分和染色面積得分的乘積進行評定。主要存在于細胞漿或細胞核中的p14ARF、mdm2、p53三種蛋白的染色均按照文獻[6]評定：不顯色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色為3分；按所取腫瘤組織被染色面積計分[7]：<25%為1分，25%～40%為2分，41%～80%為3分，>80%為4分。最終結果以染色程度與染色面積各自得分的乘積評定。0分以“-”表示為陰性，1～2分以“+”表示弱陽性，3～4分以“++”表示陽性，>4分以“+++”表示強陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，按臨床診斷試驗統(tǒng)計方法，分析各種基因蛋白表達診斷的準確度、敏感度和特異度。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表達比較 3組間p14ARF、mdm2、p53基因蛋白表達見表1，圖1見封3。

2.1.1 p14ARF蛋白表達水平比較： 健康對照組p14ARF陽性率為22.2%，增生組為75.0%，癌變組為88.0%，增生組顯著高于健康對照組，癌變組明顯高于增生組和健康對照組(P均<0.05)。由此可見p14ARF表達水平與胃癌發(fā)病相關。

2.1.2 mdm2蛋白表達水平比較： 健康對照組mdm2陽性率為27.8%，增生組為70.8%，癌變組為88.0%，增生組顯著高于健康對照組，癌變組明顯高于增生組和健康對照組(P均<0.05)。由此可見，mdm2表達水平與胃癌發(fā)病相關。

2.1.3 p53蛋白表達水平比較： 健康對照組p53陽性率為11.1%，增生組為41.7%，癌變組為48%，增生組顯著高于健康對照組，癌變組明顯高于健康對照組、增生組(P均<0.05)。由此可見， p53表達水平與胃癌發(fā)病相關。

2.2 癌變組各分型間p14ARF、mdm2、p53陽性表達比較 p14ARF、mdm2、p53陽性表達率與胃癌TNM分期、分化程度無顯著關系(P>0.05)；而有淋巴結轉(zhuǎn)移病例中p14ARF、mdm2、p53陽性表達率較無淋巴結轉(zhuǎn)移者顯著增高(P<0.05)，表明三者水平可用于檢測胃癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，見表2。

表1 3組間p14ARF、mdm2、p53基因表達蛋白的水平比較 (例)

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與增生組比較，#P<0.05

表2 癌變組各分型間p14ARF、mdm2、p53陽性表達率的比較 [例(%)]

2.3 p14ARF、mdm2、p53三者單獨及聯(lián)合用于胃癌診斷的性能比較 p14ARF、mdm2、p53聯(lián)合用于胃癌診斷的準確度為93.5%，敏感度為96.0%，特異度為95.2%，均顯著高于三者單獨診斷的性能。見表3。

表3 p14ARF、mdm2、p53三者單獨及聯(lián)合用于胃癌診斷的性能比較 (%)

注：與p14ARF、mdm2、p53三者單獨診斷比較，*P均<0.05

3 討 論

胃癌作為一類發(fā)病率較高的惡性腫瘤疾病，嚴重危害著人們的身體健康。當前，醫(yī)學對胃癌的發(fā)病機制尚不清晰，但大量研究證實[8]：組織癌變與基因的表達異常有著不可分割的聯(lián)系。基因是通過表達成蛋白質(zhì)來介導調(diào)控細胞的生長、增殖、分裂周期、凋亡。當相關基因發(fā)生突變、缺失、增長等變異時，調(diào)控蛋白水平也會表達異常，使細胞的生長、增殖、凋亡、分裂周期等失去控制發(fā)生紊亂，從而導致局部組織的癌變[9，10]。在相關癌變調(diào)控基因中大致包括兩類[11]，一類為癌變激活基因，一類為癌變抑制基因。而兩類基因主要由通路來完成對細胞凋亡生長周期的調(diào)控。當前關于人類惡性腫瘤細胞調(diào)控的通路主要有2種，即p53通路和Rb通路，其中前者為p14ARF、mdm2、p53三種基因共同通路，后者為p16INK4a、cyclinD、Rb三種基因共同通路。有研究證實p14ARF、mdm2、p53基因表達異常與子宮內(nèi)膜癌變、前列腺癌、肺癌、肝癌等均具一定相關性。

p14ARF、mdm2、p53三種基因主要通過相互作用來調(diào)控細胞癌變。p53能夠介導細胞的生長、凋亡等，具抑制細胞癌變的作用，原發(fā)性p53為一類抑制惡性腫瘤基因，半衰期較短，使用免疫組化法無法測定含量，但當原發(fā)性p53發(fā)生變異時，突變的p53不僅失去癌癥抑制作用，而且促進細胞生長，發(fā)生無限制增殖，引發(fā)癌變。同時突變的p53半衰期較長，能夠得到較多的累積，使本次研究的免疫組化測量法得以實現(xiàn)。而mdm2對細胞癌變的調(diào)控主要通過結合p53減弱其活性或誘導凋亡，阻止p53的調(diào)控作用來間接實現(xiàn)。mdm2主要通過3種方式與p53結合發(fā)揮作用：(1)抑制p53轉(zhuǎn)錄表達的活性；(2)阻止p53由核膜向胞漿轉(zhuǎn)移，使p53直接在胞漿中被相關酶體降解；(3)直接作用于p53，使其泛素化而降解。p14ARF是一類抑制癌變基因，通過介導mdm2對p53的作用來間接實現(xiàn)對癌變細胞的抑制。p14ARF主要通過3種方式來實現(xiàn)作用：(1)阻止mdm2的轉(zhuǎn)移，將其固定在核仁，解除mdm2對p53的活性抑制作用；(2)與mdm2、p53的表達物同時結合形成聯(lián)合體，阻止二者的生成，抑制癌變；(3)結合mdm2后降低其對p53的降解作用。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，p14ARF、mdm2、p53表達水平在癌變組、增生組、健康對照組呈下降趨勢(P均<0.05)，三者表達與淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關(P<0.05)，由此可見，三者的表達與胃癌發(fā)病有關；p14ARF、mdm2、p53聯(lián)合用于胃癌診斷的準確度為93.5%，敏感度為96.0%，特異度為95.2%，均顯著高于三者單獨診斷的性能，由此可見，三者聯(lián)合檢測用于胃癌的診斷有顯著臨床價值。

1 Park J, Scherer R. Adipocyte-derived endotrophin promotes malignant tumor progression[J]. Journal of Clinical Investigation，2012，122(11)：4243.

2 Calon A, Espinet E, Palomo-Ponce S, et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-β-driven program in stromal cells for metastasis initiation [J]. Cancer Cell, 2012，22(5)：571-584.

3 Ueno H, Mochizuki H, Shirouzu K, et al. Multicenter study for optimal categorization of extramural tumor :deposits for colorectal cancer staging[J]. Annals of Surgery,2012,255(4):739.

4 Halford MM,Tebbutt NC,Desai J,et al.Towards the biomarker-guided rational use of antiangiogenic agents in the treatment of metastatic colorectal cancer[J].Colorectal Cancer,2012,1(2):149-161.

5 Allen WL,Stevenson L, Coyle VM,et al.A systems biology approach identifies SART1 as a noveldeterminant of both 5-fluorouracil and SN38 drug resistance in colorectal cance[J].Molecular Cancer Therapeutics,2012,11(1)：119-131.

6 陳軍，吳飛翔，覃思繁，等. 肝細胞癌組織STAT3和p14ARF蛋白的表達和相關性研究[J].實用腫瘤雜志，2013,28(1)：24-27.

7 宋紅春，陸為民.大腸癌與p53、mdm-2、bcl-2及bax相關性的研究現(xiàn)狀[J].實用中西醫(yī)結合臨床，2013，13(8):92-94.

8 梁迎春,程龍,葉棋濃.腫瘤基因治療的研究進展[J].生物技術通訊,2012,23(3)：436-439.

9 Robbins AS,Siegel RL,Jemal A.Racial disparities in stage-specific colorectal cancer mortality rates from 1985 to 2008 [J].Journal of Clinical Oncology,2012,30(4):401-405.

10 龍海華，梁秀蘭，胡宏波,等.PTPN11基因及幽門螺桿菌與廣西柳州地區(qū)胃癌易感性關系的研究[J].疑難病雜志，2013，12(6)：436.

11 Fujioka N, Bitterman PB. Molecular targeted therapy in lung cancer [J]. Minnesota Medicine,2012,95(10)：38.

Analysisoftherelationshipbetweengastriccancerandtheabnormalexpressionofp14ARF,mdm2,p53gene

DENGXuetian,QIWenxiu,GUOHongfen.

DepartmentofPathology,BaodingSecondCentralHospital，Baoding072750,China

ObjectiveTo analyse the relationship between gastric cancer and the abnormal expression of p14ARF,mdm2,p53 gene, as while the correlation value and a joint assessment.MethodsBased on the S-P method (immunohistochemistry), 18 cases of normal gastric mucosa (control group), 24 cases of gastric mucosa hyperplasia (hyperplasia group), 50 cases of gastric cancer tissues (carcinoma group) were detected with the expression level of p14ARF,mdm2,p53 genetic samples, analyze its relationship with gastric carcinoma and for accuracy, sensitivity, specificity of diagnosis of gastric cancer.ResultsCarcinoma group, hyperplasia group, healthy control group's p14ARF(88.0%, 75.0%, 22.2%),mdm2 (88.0%, 70.8%, 27.8%),p53 expression (48.0%, 41.7%, 11.1%), the positive rate showed a downward trend (P<0.05); three expression was positively correlated with lymph node metastasis (P<0.05); p14ARF,mdm2,p53 joint for gastric cancer diagnosis accuracy was 93.4%, sensitivity was 96%, specificity was 95.2%, the performance was significantly higher than that of the three separate diagnosis.ConclusionAbnormal expression of p14ARF,mdm2,p53 genes associated with the onset and disease progression of gastric carcinoma, the expression level of the three combined detection in diagnosis and condition evaluation of gastric cancer with high clinical value.

p14ARF;mdm2;p53;Gastric cancer; Diagnostic value

072750 保定市第二中心醫(yī)院病理科

10.3969/j.issn.1671-6450.2014.06.024

2014-03-04)