杜月光， 柴可夫， 錢俊文， 章科娜

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1病理學(xué)教研室, 2中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所，浙江 杭州 310053)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的主要原因。目前認(rèn)為糖脂代謝紊亂引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用，并成為DN防治的重要靶點(diǎn)[1]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福c細(xì)胞衰老、壽命延長(zhǎng)、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等細(xì)胞多種功能活動(dòng)有關(guān)[2]。研究表明SIRT1可使NF-κB RelA/p65 亞單位去乙?；?，進(jìn)而抑制NF-κB活性，從而起到抗炎作用[3-4]，因此研究認(rèn)為SIRT1可作為抗炎治療的潛在靶點(diǎn)。本項(xiàng)目通過高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞，觀察在系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激過程中SIRT1的表達(dá)變化，并通過SIRT1的激活劑和RNAi干擾技術(shù)影響SIRT1表達(dá)，觀察其對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響，從而探討SIRT1在系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激損傷中的作用，為進(jìn)一步研究其在糖尿病腎病中的作用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(rat mesangial cells, RMC)由杭州市中醫(yī)院腎病中心惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ/EcoRⅠ和T4 DNA 連接酶(NEB)；慢病毒載體系統(tǒng)包括pTRC-EGFP、pHelper1.0和pHelper2.0載體(杭州浩基生物公司)；質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen)；SuperscriptTMII RTase(Invitrogen)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMPerfect Real Time(Takara)；總超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒(NBT法，碧云天公司)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)(Uscn E90597Ge)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)(MB100B)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1-1)(MVC00)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattratant protein 1,MCP-1)(MJE00)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)(RTA00)ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D)；抗SIRT1抗體(Abcam)；抗乙?；疦F-κB p65 抗體(Santa Cruz)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 RMC用含10% FBS和青、鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)。構(gòu)建pTRC-shSIRT1質(zhì)粒，應(yīng)用Superfectin II轉(zhuǎn)染試劑將pTRC-shSIRT1轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，離心及過濾去除上清液中的細(xì)胞碎片后，收集病毒液，之后將適量逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染至RMC，并以2 mg/L polybrene 提高轉(zhuǎn)染效率。

2.2分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)按以下分組處理：正常對(duì)照組(含1 g/L 葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)、甘露醇組(含27.8 mmol/L甘露醇的DMEM 培養(yǎng)液)、高糖組(含4.5 g/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液)、白藜蘆醇組(用1 μmol/L白藜蘆醇的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))和SIRT1 RNAi組(添加干擾病毒感染24 h后，換用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))。

2.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)終末期，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RMC，按照5×106/L的密度接種到96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基為無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 按要求分組處理。在避光條件下，每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育一定時(shí)間后，使紫色結(jié)晶全部溶解，于酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm 處的吸光度(A) 值。

2.4細(xì)胞SOD含量的檢測(cè) 收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃離心，收集上清液,按照SOD檢測(cè)試劑盒說明書操作，測(cè)定SOD活性。

2.5ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液MDA、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1的含量 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照MCP-1、VCAM-1、TNF-α、TGF-β1和MDA ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)定各指標(biāo)濃度。

2.6Real-time PCR檢測(cè)SIRT1、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄水平 收集細(xì)胞用Trizol提取RNA，測(cè)定并計(jì)算RNA的純度和濃度；取RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。采用Primer Premier 6.0和Beacon Designer軟件進(jìn)行熒光引物的設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

反應(yīng)體系中包括:ddH2O 10.5 μL，SYBR Premix EX TaqTM(2×) 12.5 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，總體系量25 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 25 s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3次。取其循環(huán)閾值(Ct)均值，分別計(jì)算各組的ΔCt(Ct內(nèi)參照基因-Ct目的基因)，再以正常組細(xì)胞為1進(jìn)行均一化，以2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7Western blotting法檢測(cè)SIRT1和乙酰化NF-κB蛋白的表達(dá) 采用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。取60 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放入T-TBS(含5%脫脂奶粉)封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(SIRT1 1∶1 000,乙酰化NF-κB 1∶500)洗膜，然后用Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，在暗室中用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，拍片晾干，計(jì)算機(jī)掃描，采用Bandscan 5.0軟件分析條帶的吸光度。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照β-actin吸光度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞活力比較

高糖刺激造成RMC的活力下降，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇干預(yù)可有效抑制高糖誘導(dǎo)引起的細(xì)胞活力下降(P<0.05)。SIRT1干擾可引起RMC的活力降低，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The viability of RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose.

2 各組細(xì)胞MDA含量及SOD活性的比較

高糖誘導(dǎo)引起RMC MDA分泌增加，SOD活性降低，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(分別P<0.05和P<0.01)。白藜蘆醇可以保護(hù)細(xì)胞的SOD活性，抑制高糖刺激引起的MDA分泌(P<0.01)。SIRT1 RNAi使高糖誘導(dǎo)的RMC MDA含量增加，SOD活性降低，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)，見表2。

3 各組細(xì)胞SIRT1、MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1 mRNA 表達(dá)的比較

高糖刺激造成RMC的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)上升，與正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇可以抑制高糖刺激引起的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)上升(P<0.01)。SIRT1 RNAi引起RMC的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1mRNA表達(dá)上升，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

表2 各組細(xì)胞MDA含量及SOD活性的比較

Figure 2. The mRNA expression of SIRT1, MCP-1, TGF-β1, VCAM-1 and TNF-α in RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control; △△P<0.01 vs high glucose.

4 各組細(xì)胞上清液中MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1蛋白含量的比較

高糖刺激引起細(xì)胞分泌MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1增加，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。白藜蘆醇預(yù)處理后，可以抑制高糖刺激引起的MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1含量的增加(P<0.01)。SIRT1干擾引起MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1的表達(dá)上升，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3. The protein concentrations of MCP-1, TNF-α and TGF-β1 in the RMC culture supernatant.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs Control; △△P<0.01 vs high glucose.

Figure 4. The protein concentration of VCAM-1 in the culture supernatant of RMC with different treatments.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose

5 各組SIRT1蛋白和乙?；疦F-κB蛋白的表達(dá)

高糖誘導(dǎo)可使細(xì)胞表達(dá)SIRT1蛋白降低，乙?；疦F-κB蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。白藜蘆醇可以促進(jìn)SIRT1蛋白的表達(dá)，使NF-κB p65乙?；浇档?P<0.01)。SIRT1干擾可使高糖誘導(dǎo)的RMC SIRT1蛋白表達(dá)減少，乙?；疦F-κB p65蛋白表達(dá)增加，和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The protein expression of SIRT1 and acetylated NF-κB p65 in RMC with different treatments. 1: control group; 2: mannitol group; 3: high glucose group; 4: resveratrol group; 5: SIRT1 RNAi group. **P<0.01 vs control;△△P<0.01 vs high glucose.

討 論

DN是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是引起終末性腎病的主要原因，已成為全球日益關(guān)注的公共健康問題。糖尿病腎病主要以毛細(xì)血管基底膜增厚及腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚為主要病理改變。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。

目前已經(jīng)明確，高糖是引起糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病腎病的始動(dòng)因素。高糖介導(dǎo)引起的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)大量產(chǎn)生，甘油二脂/蛋白激酶C活性的提高，多元醇通路的激活等是引起DN的經(jīng)典途徑。除此之外，越來越多的證據(jù)表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是引起腎損傷的主要介質(zhì)。因此目前治療DN的主要手段：在降糖基礎(chǔ)上，抑制RAS活化，但在DN的臨床治療中發(fā)現(xiàn)以上的治療，并不能有效地控制其發(fā)展的進(jìn)程[5]。近幾年的研究表明，炎癥是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]，NF-κB及許多炎癥因子均發(fā)揮致病作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究顯示[6]，高脂高糖加小劑量STZ復(fù)制的2型糖尿病大鼠，隨著病變的加重，腎臟組織出現(xiàn)炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，大鼠血清ICAM-1、MCP-1和TNF-α的含量增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖可引起系膜細(xì)胞活力下降，氧化應(yīng)激加強(qiáng)，炎癥因子MCP-1、VCAM-1、TNF-α和TGF-β1表達(dá)增加，也進(jìn)一步證實(shí)炎癥在糖尿病腎病中的損傷作用。

NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。眾多研究表明，NF-κB與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)[8-9]：在糖尿病狀態(tài)下，高血糖、AGEs、血管緊張素Ⅱ及氧化應(yīng)激等均可激活NF-κB。NF-κB 激活導(dǎo)致多種炎癥因子、細(xì)胞因子及黏附分子等表達(dá)分泌異常，進(jìn)而引起腎小球血管通透性增加、腎組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、系膜區(qū)基質(zhì)堆積及腎小管間質(zhì)纖維化。因此，抑制NF-κB的活化在防治糖尿病腎病中具有重要的意義。

NF-κB是由p50和p65兩個(gè)蛋白亞基組成的二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB相結(jié)合，使NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激后，IκB 發(fā)生酶解，NF-κB被活化。近年研究表明，NF-κB p65的乙?；秸{(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[10-11]：在p300和CBP的乙?；饔孟拢琋F-κB p65 310賴氨酸殘基乙?；琑elA/p65亞單位不能與IκBα結(jié)合，進(jìn)入核內(nèi)，與DNA相關(guān)元件結(jié)合，刺激相關(guān)基因表達(dá)。相反，RelA/p65亞單位的去乙酰化，允許NF-κB/IκBα相互作用，進(jìn)而抑制NF-κB活性。

SIRT1 是煙堿腺嘌呤二核苷酸依賴性的sirtuin(silent mating type information regulation 2 homolog)去乙酰化酶家族中的一員，在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)。它不僅調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；€通過表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，參與基因沉默，與細(xì)胞衰老、壽命延長(zhǎng)、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等細(xì)胞多種功能活動(dòng)有關(guān)，在衰老性疾病和代謝性疾病的組織保護(hù)中起重要作用[2]。

越來越多的證據(jù)顯示，SIRT1激活能使NF-κB的RelA/p65亞單位去乙?；?，抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，在炎癥損傷中起保護(hù)作用。Jung等[3]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1高表達(dá)通過降低NF-κB亞單位RelA/p65乙?；瘡亩鴾p輕cisplatin對(duì)腎小管細(xì)胞的毒性作用；Chen等[4]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SIRT1可通過NF-κB亞單位RelA/p65去乙?；@著降低淀粉樣β 蛋白誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，并抑制炎癥反應(yīng)對(duì)原皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用；相反，減少SIRT1使NF-κB p65乙?；撸M(jìn)而炎癥相關(guān)因子表達(dá)增加[12]。另外，研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，限制熱量攝入可通過激活SIRT1進(jìn)而抑制炎癥和促進(jìn)自噬改善糖尿病腎病；SIRT1的激活劑白藜蘆醇可減輕高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和維持正常的線粒體結(jié)構(gòu)和功能，阻斷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡，這提示SIRT1對(duì)糖尿病腎臟也具有保護(hù)作用，可能是治療糖尿病腎病的有效靶點(diǎn)。但SIRT1的激活是否影響高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞NF-κB的乙?；郊跋嚓P(guān)因子的分泌，從而起到保護(hù)作用，尚未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞SIRT1表達(dá)減少，NF-κB p65的乙?；浇档?。SIRT1的激活劑白藜蘆醇可降低高糖誘導(dǎo)的NF-κB p65的乙酰化水平，降低TNF-α、MCP-1、VCAM-1、TGF-β1等炎癥因子的產(chǎn)生；RMC經(jīng)沉默SIRT1處理，可使NF-κB p65的乙?；矫黠@升高。以上結(jié)果提示，SIRT1的激活，對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是SIRT1通過去乙?；饔糜贜F-κB的亞單位RelA/p65，減少NF-κB與核內(nèi)炎癥基因結(jié)合，進(jìn)而減少TNF-α、MCP-1、VCAM-1、TGF-β1等炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，高糖可降低SIRT1水平及活性，引起氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)系膜細(xì)胞損傷。SIRT1的激活可以拮抗高糖誘導(dǎo)引起的細(xì)胞損傷作用，其機(jī)制之一可能使NF-κB 的亞單位RelA/p65去乙?；瑥亩种蒲装Y因子的產(chǎn)生。由此我們相信SIRT1可作為治療DN的潛在靶點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Luis-Rodríguez D, Martínez-Castelao A, Górriz JL, et al. Pathophysiological role and therapeutic implications of inflammation in diabetic nephropathy[J]. World J Diabetes, 2012, 3(1):7-18.

[2] Kong XX, Wang R, Liu XJ, et al. Function of SIRT1 in physiology[J]. Biochemistry (Mosc), 2009, 74(7):703-708.

[3] Jung YJ, Lee JE, Lee AS, et al. SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF-κB p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 419(2):206-210.

[4] Chen J, Zhou Y, Mueller-Steiner S, et al. SIRT1 protects against microglia-dependent amyloid-beta toxicity through inhibiting NF-κB signaling[J]. J Biol Chem, 2005, 280(48): 40364-40374．

[5] Balakumar P, Arora MK, Ganti SS , et al. Recent advances in pharmacotherapy for diabetic nephropathy: current perspectives and future directions[J]. Pharmacol Res, 2009, 60(1):24-32.

[6] 杜月光，錢俊文，宋光明，等. LOX-1在2型糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)中的表達(dá)及其意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(1):50-55.

[7] Hayden MS, Ghosh S. NF-kappaB, the first quarter-century: remarkable progress and outstanding questions[J]. Genes Dev, 2012, 26(3):203-234.

[8] Navarro-González JF, Mora-Fernández C, Muros de Fuentes M, et al. Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Nat Rev Nephrol, 2011, 7(6):327-340．

[9] Chen LF, Greene WC. Regulation of distinct biological activities of the NF-kappaB transcription factor complex by acetylation[J]. J Mol Med, 2003, 81(9):549-557.

[10] Sanz AB,Sanchez-Nio MD,Ramos AM, et al.NF-κB in renal inflammation[J]. J Am Soc Nephrol, 2010, 21(8):1254-1262.

[11] Kiernan R, Bres V, Ng RW, et al. Post-activation turn-off of NF-kappa B-dependent transcription is regulated by acetylation of p65[J]. J Biol Chem, 2003, 278(4):2758-2766.

[12] Zhu X, Liu Q, Wang M, et al. Activation of SIRT1 by resveratrol inhibits TNF-alpha induced inflammation in fibroblasts[J]. PLoS One, 2011, 6(11):e27081.

[13] Kitada M, Takako A, Naqak T, et al. Dietary restriction ameliorates diabetic nephropathy through anti-inflammatory effects and regulation of the autophagy via restoration of SIRT1 in diabetic Wistar fatty (fa/fa) rats: a model of type 2 diabetes[J]. Exp Diabetes Res, 2011, 2011:908185.

[14] Xu Y, Nie L, Yin YG,et al. Resveratrol protects against hyperglycemia-induced oxidative damage to mitochondria by activating SIRT1 in rat mesangial cells[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 259(3):395-401.

[15] Kume S, Haneda M, Kanasaki K, et al. SIRT1 inhibits transforming growth factor beta-induced apoptosis in glomerular mesangial cells via Smad7 deacetylation[J]. J Biol Chem, 2007, 282(1):151-158.