毛晨熙， 陸 地， 孫成超

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，浙江 溫州 325000)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)因其取材方便、無免疫排斥反應(yīng)、具有多向分化潛能等優(yōu)勢(shì)而成為再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)種子細(xì)胞[1]。干細(xì)胞治療臨床前研究表明，移植細(xì)胞的數(shù)量、種類，及移植的時(shí)間是制約干細(xì)胞治療療效的關(guān)鍵[2]。因此，如何在短時(shí)間內(nèi)獲得更多的干細(xì)胞成為干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵因素。

MicroRNA是一種由20～23個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的短片段RNA，能通過抑制靶蛋白mRNA的表達(dá)及促進(jìn)其降解發(fā)揮作用[3]。在干細(xì)胞領(lǐng)域較多的microRNA被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用[4]。因此，本研究將集中探究microRNA-193 (miR-193)在MSCs增殖過程中的功能，及其可能的作用通路。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重為60～80 g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Invitrogen，siPORT NeoFX Transfection Agent及TaqMan MicroRNA Assay系統(tǒng)均購(gòu)自Ambion，miR-193轉(zhuǎn)染片段和抑制劑購(gòu)自上海GenePharma，MTS檢測(cè)試劑盒和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega，BrdU增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Calbiochem，Ki-67抗體購(gòu)自Abcam，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen。

3 主要方法

3.1MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取60～80 g SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡3～5 min，取股骨、脛骨，PBS洗去殘留血液。剪去股骨、脛骨兩端骨骺，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔中細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。原代培養(yǎng)48 h換液1次，細(xì)胞達(dá)80～90%時(shí)1∶3傳代，3～4代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSCs表面抗原類型。

3.2miR-193及其抑制劑轉(zhuǎn)染 MSCs密度達(dá)60%～70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-193片段(pre-miR-193)或其陰性對(duì)照(miRNA mimic)以及miR-193抑制劑(anti-miR-193)或其陰性對(duì)照(miRNA inhibitor),miRNA mimic和miRNA inhibitor組作為陰性對(duì)照組(NC-mim和NC-inh)，轉(zhuǎn)染終濃度為30 nmol/L，轉(zhuǎn)染后24～72 h進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。轉(zhuǎn)染一般步驟參見siPORT NeoFX Transfection Agent(Ambion)轉(zhuǎn)染說明書。熒光染色和qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。相關(guān)miRNA序列見表1。

表1 miRNA序列

3.3MTS細(xì)胞增殖檢測(cè) MSCs經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理，分別取轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的細(xì)胞，將其接種到96孔板上，再加入20 μL MTS，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度。

3.4BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 將MSCs接種到96孔板，經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔細(xì)胞中加入20 μL BrdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行檢測(cè)。

3.5細(xì)胞免疫組化染色 將經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理后的各組MSCs接種到蓋玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，0.3%Triton X-100孵育10 min，再用1%BSA封閉20 min，加入Ki-67(1∶200)4 ℃下孵育過夜。用PBS浸洗3次后，加入FITC標(biāo)記的II抗工作液37 ℃孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

3.6Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理后MSCs，在低血清DMEM培養(yǎng)液里培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，Annexin V/PI染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡/壞死細(xì)胞(分別標(biāo)記為Annexin V-/PI-、Annexin V+/PI-、Annexin V+/PI+)。

3.7細(xì)胞周期相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)檢測(cè) 將經(jīng)3.2轉(zhuǎn)染處理的各組MSCs按試劑盒中方法進(jìn)行總RNA提取，檢測(cè)A260/A280以判定RNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，再進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。相關(guān)引物序列見表2。

表2 引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MSCs鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的MSCs表面抗原結(jié)果，CD29陽性率99.64%，CD44陽性率97.97%，CD34陽性率只有6.25%，CD45陽性率僅為3.35%，符合已知的MSCs表面抗原特點(diǎn)，表明本實(shí)驗(yàn)所使用細(xì)胞確為大鼠MSCs，見圖1。

Figure 1. Flow cytometry analysis was used to evaluate surface antigen expression in MSCs.

2 miR-193轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率檢測(cè)

構(gòu)建短片段miR-193對(duì)MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。攜帶熒光的miR-193片段能較好的轉(zhuǎn)染MSCs，熒光發(fā)光比例能達(dá)到70%以上，見圖2A。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-193或其抑制劑分別顯著增加或抑制MSCs中miR-193的表達(dá)量(均P<0.01),見圖2B。

3 miR-193對(duì)MSCs增殖水平的影響

3.1MTS檢測(cè)MSCs增殖能力變化 在MSCs轉(zhuǎn)染miR-193后24 h、48 h及72 h分別與對(duì)照組相比，MSCs增殖能力顯著增高，抑制miR-193的表達(dá)則能造成MSCs增殖能力的下降，以24 h和72 h最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見圖3。

3.2BrdU檢測(cè)MSCs增殖能力變化 miR-193能夠顯著改變轉(zhuǎn)染24 h后MSCs的增殖狀態(tài)，過表達(dá)miR-193促進(jìn)MSCs的增殖，而抑制miR-193則能夠抑制MSCs的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見圖4。

3.3細(xì)胞大體變化及Ki-67染色 采用Ki-67染色來明確miR-193轉(zhuǎn)染后MSCs核增殖狀態(tài)的變化，并在大體上對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-193能增加Ki-67染色陽性細(xì)胞數(shù)，而抑制miR-193表達(dá)則會(huì)造成陽性細(xì)胞的減少，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5。

Figure 2. Transfection efficiency of miR-193 in MSCs.A: transfected MSCs with FAMTM dye-labeled miR-193 for 2 days (scale bars: 50 μm);B: the miR-193 expression detected by qRT-PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 3. miR-193 regulated proliferation of MSCs at different time points. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 4. Effect of miR-193 on the proliferation of MSCs detected by BrdU incorporation assay after transfection for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

以上結(jié)果通過3種不同的方法，從不同層面證明了miR-193能夠增強(qiáng)大鼠MSCs的增殖能力。

4 miR-193對(duì)MSCs凋亡水平的影響

miR-193抑制組的早期凋亡率要略低于對(duì)照組和過表達(dá)組，但各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而miR-193過表達(dá)組的晚期凋亡水平要略高于對(duì)照組和抑制組，但各組間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

5 miR-193調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

MSCs過表達(dá)miR-193能增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)mRNA的表達(dá)，相反抑制miR-193則下調(diào)CDK2 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。此外，miR-193僅引起CDK2的表達(dá)改變，對(duì)于其它細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)則沒有顯著影響，見圖7。

Figure 5. Effect of miR-193 on the proliferation of MSCs detected by Ki-67 immunostaining (scale bars: 50 μm). Green fluorescence indicates Ki-67-positive cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs NC-mim or NC-inh.

Figure 6. miR-193 couldn’t regulate the apoptosis of MSCs. Apoptosis of MSCs was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.

討 論

早在1960年，Hayflick就通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs與其它體細(xì)胞一樣具有有限的增殖能力，這一現(xiàn)象被譽(yù)為Hayflick現(xiàn)象[5]。近期也有研究表明小鼠和人類的MSCs在長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，它們的增殖能力隨著代數(shù)的增加而減少[6]。如何提高M(jìn)SCs的增殖能力對(duì)于提高細(xì)胞治療的療效起著重要的作用。

部分miRNA被發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞增殖能力相關(guān)，如在胚胎干細(xì)胞中敲除Dicer或Dgcr8這2種對(duì)于miRNA合成至關(guān)重要的酶，將導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞增殖能力的明顯降低；而miR-290家族則被證明能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖[7]。本研究通過對(duì)miR-193的過表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)，使用3種檢測(cè)方法，從不同層面證實(shí)miR-193能顯著改變MSCs的增殖能力。為明確miR-193過表達(dá)后MSCs數(shù)量的增多是否是由miR-193對(duì)MSCs凋亡水平的調(diào)控引起的，本研究又通過流式細(xì)胞技術(shù)證明miR-193不影響MSCs的凋亡水平。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能調(diào)控大量的細(xì)胞周期因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖[8]。在本研究中，使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)MSCs中部分細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-193能顯著升高CDK2的表達(dá)水平。而CDK2在細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用，CDK/cyclin復(fù)合物能夠調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的過程[9]，這一過程的長(zhǎng)短正是細(xì)胞增殖能力強(qiáng)弱的表現(xiàn)[10]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，CDK2可能通過改變?nèi)祟惣?xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的應(yīng)答能力來調(diào)控細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖能力[11]。因此推測(cè)miR-193調(diào)控MSCs增殖能力的功能可能是通過調(diào)控CDK2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

Figure 7. Effects of miR-193 on the mRNA expression of cell cycle-related proteins in MSCs detected by qRT-PCR. CCNA2:cyclin A2；CCNB1:cyclin B1；CDK2: cyclin-dependent kinase 2; CCND1:cyclin D1；CCNE1:cyclin E1.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs NC-mim or NC-inh.

綜上所述，miR-193可能通過增強(qiáng)CDK2的表達(dá)，最終上調(diào)MSCs的增殖水平。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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