王明珍， 裘月紅， 穆 琳， 鄭 偉

(1浙江省桐廬縣第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 桐廬 311500； 2浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院婦科，浙江 杭州 310009)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)的一個具有侵襲性的良性病變[1]，其發(fā)病率約為5%～15%[2]，可引起多種形式的臨床表現(xiàn)，治療后復發(fā)率高，但其發(fā)病機制仍未完全闡明。EM又是一種雌激素依賴性疾病,雌二醇(estradiol,E2)在EM發(fā)病中作用已有大量研究[3]。李華軍等[4]報道EM在位內(nèi)膜細胞對E2的反應性有別于正常婦女子宮內(nèi)膜細胞,處于一種超敏狀態(tài)。EM在位內(nèi)膜細胞對外源性E2刺激的超敏狀態(tài),可能在一定濃度的E2作用下,使逆流入盆、腹腔的內(nèi)膜碎片易侵襲、形成新生血管及分裂增殖,最終形成病灶。我們以前的研究中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)在EM在位內(nèi)膜中表達增高,并與臨床病理特征呈現(xiàn)相關(guān)性[5]。本研究通過原代培養(yǎng)分離EM與對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞,觀察雌激素對其分泌的MIF表達水平是否有影響, 以進一步探討MIF在EM發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

所有病例均選自2009年3月至2010年12月在浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院住院接受腹腔鏡手術(shù)或開腹手術(shù)患者，均無內(nèi)科合并癥，術(shù)前3個月內(nèi)未接受任何抗感染治療和激素治療并具有規(guī)則的月經(jīng)周期，內(nèi)異組共11例，患者年齡為24～46歲，平均(36±3)歲，均已有婚育史，手術(shù)方式為囊腫剔除或患側(cè)附件切除術(shù)，術(shù)中同時刮取子宮內(nèi)膜組織，術(shù)后病理診斷為卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者。對照組：共12例，患者年齡為27～45歲，平均(37±4)歲，其中因不孕行腹腔鏡檢查者5例，因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)者7例，并排除子宮腺肌病患者，手術(shù)過程中檢查證實無EM病灶及炎癥。2組患者年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。該研究報浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準，并通過患者知情同意。

2 方法

2.1標本處理 在無菌條件下刮取新鮮子宮標本的內(nèi)膜組織，立即放入含2%FBS的DMEM/F12細胞培養(yǎng)液中，迅速低溫轉(zhuǎn)移至實驗室操作。全部標本均留部分組織用10%甲醛液固定后進行病理學檢查，內(nèi)膜組織學檢查均未發(fā)現(xiàn)病理改變， 其組織學分期與月經(jīng)周期相符。

2.2子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 將所獲子宮內(nèi)膜組織用PBS洗滌2～3次，用眼科剪將其剪成0.5 mm×1 mm×1 mm大小碎塊后加入2倍組織體積的膠原酶Ⅰ(0.2%)，37 ℃水浴箱振蕩消化30 min；用2% FBS細胞培養(yǎng)液漂洗2～3次，加入2倍組織體積的消化酶Ⅱ(0.1%膠原酶+0.01%DNase)混合消化液, 37℃水浴箱振蕩消化30 min；100目細胞篩過篩去除大塊未消化組織，2%FBS細胞培養(yǎng)液漂洗2～3次，800 r/min離心10 min，去除上清液；沉淀、細胞篩過濾并收集通過濾網(wǎng)的細胞濾過液吸到離心管中，500 r/min離心，棄上清，將沉淀用D-Hanks液進行沖洗，再進行離心，反復進行2次后加入10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)液，經(jīng)0.4%臺盼藍染色以測定細胞活性并細胞計數(shù)后接種于培養(yǎng)板，置37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察細胞有無貼壁； 10%FBS細胞培養(yǎng)液終止消化；略吹打后收集細胞，細胞計數(shù)后接種于培養(yǎng)板；用2%FBS細胞培養(yǎng)液換液，待細胞融合率達到50%～60%時，加入含1%活性炭吸附血清的無酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基作用至細胞融合率達70%～80%時，分別加入10-7nmol/L E2,分別于培養(yǎng)6、12、24、48 h后收集細胞。對照組培養(yǎng)液內(nèi)不加任何激素，對照組及各實驗組均三皿平行，實驗重復3次，培養(yǎng)24 h后收集細胞行RT-PCR及蛋白免疫印跡檢測；其中一部分細胞接種至放有蓋玻片的6孔板中同法培養(yǎng)，待細胞在玻片上鋪成單層，取出玻片，用CD10為Ⅰ抗進行細胞免疫組化鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞,判斷間質(zhì)細胞的純度，細胞純度達90%以上則進行下一步實驗。

2.3細胞免疫組化鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞 待蓋玻片上的子宮內(nèi)膜細胞基本鋪成單層，自6孔板內(nèi)取出蓋玻片，用PBS洗3次；固定、PBS沖洗并浸泡其中3次；用非免疫動物血清以蓋滿載玻片為止，吸干血清后分別加入1∶100稀釋的CD10抗體，并以PBS代替Ⅰ抗作陰性對照，室溫孵育2 h；加入Ⅱ抗，室溫孵育30 min；DBA顯色，作用2～5 min，(顯微鏡下控制)后PBS沖洗干凈，吸干； 蘇木素復染，中性樹脂封片；顯微鏡下觀察。

2.4RT-PCR檢測MIF mRNA表達 取RNA提取液2 μL，加入98 μL RNase-free純水混勻，DU-640紫外分光光度儀測A260/A280，檢測核酸純度，計算核酸量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后 PCR擴增，引物序列見表1。為控制實驗操作時的加樣誤差和各反應管擴增效率的差異，設立GAPDH作為內(nèi)參照，并把循環(huán)周期控制在擴增反應線性期。取10 μL PCR產(chǎn)物，加6×凝膠電泳加樣緩沖液2 μL，混勻后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L溴化乙啶)電泳，紫外線下拍照，Kodak EDAS 290成像系統(tǒng)攝像，KodakID 3.5軟件系統(tǒng)測DNA條帶的灰度，目的條帶灰度與GAPDH條帶灰度的比值為標本MIF mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列

2.5蛋白免疫印跡法檢測MIF蛋白表達 刮取收集細胞，PBS沖洗3遍，600×g離心10 min，置液氮10 min后，-80 ℃冰箱內(nèi)保存；提取蛋白，分裝，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存；蛋白質(zhì)定量分析：灌膠、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、棄去封閉液，立即加入I抗稀釋液與硝酸纖維素膜一起孵育(抗MIF抗體稀釋度為1∶200，β-actin稀釋度為1∶400)，混合顯色A、B液各2 mL，5 min后將其與硝酸纖維素膜孵育1 min，放射自顯影，曝光3～5 min，沖洗膠片；將放射自顯影條帶進行掃描，用Bio-Rad公司的Quantity One分析軟件對顯影條帶進行灰度分析，將目的條帶灰度與β-actin灰度的比值作為目的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件分析。資料正態(tài)性用Kolmogorov-Smirnov檢驗，方差齊性用Levene檢驗。經(jīng)檢驗所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)或近似正態(tài)分布，方差均具有齊同性，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用One-way ANOVA對MIF表達水平進行比較，如有統(tǒng)計學意義，再行組內(nèi)兩兩Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 培養(yǎng)細胞形態(tài)特點

子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞接種30 min后開始貼壁，24 h后已完全貼壁。多呈梭形，偶見多角形，胞質(zhì)薄而透明，核呈橢圓形，易出現(xiàn)平行排列生長，48 h內(nèi)可見分散生長，3 d后亦出現(xiàn)并行排列生長。培養(yǎng)到5 d，細胞排列緊密，并融合成片，細胞多為紡錘形或多角形，邊界清楚，胞體透明，胞漿中顆粒豐富，核大而圓，核仁明顯，細胞鋪滿瓶底后用消化液傳代。傳代后細胞外形多呈梭形，貼壁快。免疫組化染色，90%以上的細胞CD10呈陽性染色，見圖1。

Figure 1. Immunohistochemical identification of the cultured endometrial stromal cells (×400). A: negative control; B: CD10 positive.

2 E2對正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中MIF表達的調(diào)節(jié)

RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，組織標本中MIF mRNA擴增產(chǎn)物為620 bp，GAPDH為452 bp。目的條帶與內(nèi)參照比較，進行半定量分析，其相對表達量均符合正態(tài)分布。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，所有的細胞標本中均在43 kD處檢測到內(nèi)參照β-actin，其表達強度基本一致，處理組和對照組細胞中均能檢測到MIF。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞經(jīng)E2作用24 h后MIF mRNA及蛋白水平明顯增高(P<0.05),見圖2、3。

Figure 2. MIF mRNA expression in cultured endometrial stromal cells was assessed by RT-PCR. A: cultured endometrial stromal cells from EM (no estrogen); B: cultured endometrial stromal cells from EM (treated with estrogen);C: cultured endometrial stromal cells from women with EM(no estrogen); D: cultured endometrial stromal cells from women without EM (treated with estrogen).Mean±SD. n=3.△P<0.05 vs A or C.

Figure 3. MIF protein expression in cultured endometrial stromal cells was assessed by Western blotting. A: cultured endometrial stromal cells from EM (no estrogen); B: cultured endometrial stromal cells from EM (treated with estrogen); C: cultured endometrial stromal cells from women with EM (no estrogen); D: cultured endometrial stromal cells from women without EM (treated with estrogen).Mean±SD.n=3.△P<0.05 vs A or C.

3 在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中MIF表達對雌激素的反應

E2作用后MIF表達水平減去空白對照組MIF表達水平為E2作用后細胞MIF蛋白上調(diào)水平，MIF蛋白上調(diào)水平(0.037±0.005)明顯高于正常組(0.031±0.003)(P<0.01)。

討 論

雌激素誘導細胞變化可以通過不同的機制，其核心是與雌激素結(jié)合的雌激素受體(estrogen receptor,ER)，雌激素彌散入細胞，與位于細胞核上的ER結(jié)合形成雌激素-ER復合物，該復合物與雌激素反應元件通過蛋白質(zhì)與雌激素應答基因啟動子區(qū)域的激活蛋白因子或特異性β1糖蛋白直接或間接相互作用，導致共調(diào)節(jié)蛋白(共激活劑或共抑制劑)對啟動子的作用恢復，調(diào)節(jié)mRNA水平和相關(guān)蛋白的形成以及相應的生理反應。該過程發(fā)生需要數(shù)小時的時間，是雌激素的“經(jīng)典機制”或“基因組機制”。雌激素還可以在更短的時間內(nèi)(幾秒或幾分鐘)通過非基因機制起作用，通過局部的ER或者細胞膜間的連接或其它和雌激素結(jié)合有關(guān)的非細胞膜上的ER，引起細胞反應。本研究通過建立體外子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)體系，消除體內(nèi)各種復雜因素影響，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞在給予不同藥物刺激時，其MIF mRNA和蛋白的表達量有所變化，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞經(jīng)雌激素作用24 h后MIF mRNA及蛋白水平明顯增高。關(guān)于雌激素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞MIF表達影響本研究僅僅做了初步探索，其具體信號途徑尚需進一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)EM在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞在雌激素作用后MIF水平上調(diào)并高于正常組，提示EM在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中MIF的表達對雌激素的刺激更加敏感。有研究認為EM是一種激素依賴性疾病，多發(fā)生于中青年婦女，雌激素在EM發(fā)病中的作用已有大量研究[3]，但患者體內(nèi)的雌激素水平并不高于正常水平。李華軍等[4]曾經(jīng)報道EM在位內(nèi)膜細胞對雌二醇的反應性有別于正常婦女子宮內(nèi)膜細胞，在EM體外細胞模型上直接觀察到雌激素有刺激血管內(nèi)皮生長因子、金屬基質(zhì)蛋白酶分泌和促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，影響的程度均強于正常婦女的子宮內(nèi)膜細胞，即EM在位內(nèi)膜細胞對外源性雌激素的刺激處于一種超敏狀態(tài)。我們的研究結(jié)果顯然也驗證了EM內(nèi)膜間質(zhì)細胞對雌激素的超敏狀態(tài)。關(guān)于在EM形成這種狀態(tài)的機制，Bulun等[3]研究發(fā)現(xiàn)雌激素刺激RM在位內(nèi)膜細胞前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)合成，PGE2又刺激這些細胞中芳香化酶P450的活性，使其合成更多的雌激素，形成一個正反饋，外源性雌激素觸發(fā)了這一反饋,而正常婦女子宮內(nèi)膜沒有這種機制。EM在位內(nèi)膜細胞對外源性雌激素刺激的超敏狀態(tài)，可能至少部分歸因于這種正反饋，從而在一定濃度的雌激素作用下，EM在位內(nèi)膜MIF表達增高，使逆流入盆、腹腔的內(nèi)膜碎片易侵襲、形成新生血管及分裂增殖，最終形成異位病灶[6]。

根據(jù)本實驗中EM對雌激素刺激表現(xiàn)出來的差異，推測EM子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中MIF的表達對雌激素的刺激呈現(xiàn)超敏狀態(tài)，由此使子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞內(nèi)MIF表達升高，進而促進了EM的發(fā)生發(fā)展，該結(jié)果可能為臨床EM的治療提供了新的思路和方法。

[參 考 文 獻]

[1] Bulletti C, Flamigni C, de Ziegler D. Implantation mar-kers and endometriosis[J]. Reprod Biomed Online, 2005,11(4):464-468.

[2] Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, et al. Endometriosis and infertility: a laparoscopic study of endometriosis among fertile and infertile women[J]. Fertil Steril,1982,38(6):667-672.

[3] Bulun SE, Cheng YH, Yin P, et al. Progesterone resis-tance in endometriosis: link to failure to metabolize estra-diol[J]. Mol Cell Endocrinol, 2006, 248(1-2): 94-103.

[4] 李華軍, 郎景和, 劉珠鳳，等. 子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細胞對雌二醇超敏狀態(tài)的研究[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2007,16(6):449-452.

[5] 裘月紅, 穆 琳, 王 良，等. 巨噬細胞移動抑制因子在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜中的表達及其意義[J]. 中華婦產(chǎn)科學雜志, 2007,42(12):856-858.

[6] 李洪義, 鄭 輝, 段 山,等. 內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜ER、PR 基因表達的研究[J].中國病理生理雜志, 2003, 19(4): 529-532.