陳海飛，鮑蕾蕾，孫 艷,2，許志仁,2，范正平，卞 俊*

(1.解放軍第四一一醫(yī)院藥學(xué)科，上海 200434；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，南昌 333004)

愈骨療傷方劑(Yuguliaoshang recipe，YGLS)是由解放軍第四一一醫(yī)院中醫(yī)科李念群主任醫(yī)師提供的祖?zhèn)髅胤?。該方在治療過(guò)程中，以整體觀為主要思想，并根據(jù)魏氏傷科學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，以早期活血化瘀，中期和血生新，后期固本培元等治療原則創(chuàng)制。臨證立足中醫(yī)，詳細(xì)審證，辨證辨病，治傷重視氣血，調(diào)攝脾胃。本方選用中藥川斷、骨碎補(bǔ)、土鱉蟲(chóng)、當(dāng)歸、生地、白芍、沒(méi)藥、乳香、鹿角霜、煅自然銅、甘草11味中藥組方，具有活血化瘀、續(xù)骨愈傷、消腫止痛之功效。用于外傷等引起的骨折、骨碎、骨裂、頸椎病及關(guān)節(jié)、軟組織損傷所引起的腫脹、疼痛等。YGLS作為祖?zhèn)髅胤皆诒驹号R床應(yīng)用30多年，療效明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)藥效學(xué)研究評(píng)價(jià)YGLS水提和醇提兩種提取工藝，對(duì)該方治療骨折愈合的效果，以篩選出YGLS的最佳提取工藝。

1 材料和方法

1.1 藥品和儀器 YGLS醇提取物和水提取物， 均為本院藥學(xué)科制劑室自制的粉劑， 臨用前分別加入蒸餾水配制成混懸液。水提取物3種混懸液的濃度為5.2%、10.6%和21.2%，醇提取物3種混懸液的濃度為3.2%、6.4%和12.8%。傷科接骨片(批號(hào) 200906326，大連美羅中藥材有限公司)，將其研磨成粉末后加入蒸餾水配制成8%混懸液。麝香接骨膠囊(批號(hào) 090301，吉林省輝南天宇藥業(yè)股份有限公司)，將其研磨成粉末后加入蒸餾水配制成8%混懸液。戊巴比妥鈉(批號(hào)WS 20110112，美國(guó)Sigma公司)；注射用青霉素鈉(批號(hào) A110203116，哈藥集團(tuán)制藥總廠)。TJL16 離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器廠)；Vitro 3350血液生化儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)； CX31顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 家兔及分組 健康新西蘭大白兔60只[第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0007]，雌雄各半，體重為2.0～2.5 kg。采用體重分層隨機(jī)數(shù)字表將家兔分成10組：對(duì)照組、模型組、2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組(傷科接骨片和麝香接骨膠囊組)、3個(gè)YGLS水提取物組和3個(gè)YGLS醇提取物組。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，YGLS低、中、高劑量分別為0.8、1.6、3.2 g生藥/kg體重。水提取物的得率為33%，3個(gè)YGLS水提取物組給予水提取物粉末的量為0.26、0.53、1.06 g/kg。醇提取物的得率為20%，3個(gè)YGLS醇提取物組給予醇提取物粉末的量為0.16、0.32、0.64 g/kg。

1.3 骨折模型的制備[1]大白兔靜脈注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉。仰臥固定后，剪去右側(cè)脛骨處的兔毛，消毒皮膚，用手術(shù)刀切開(kāi)脛骨上方的皮膚，分離肌肉及肌膜，暴露脛骨。用雙層鋼鋸造成新西蘭大白兔脛骨中段不完全性骨折，骨折處寬約3 mm，深度為脛骨直徑的1/2。縫合皮下組織及皮膚。手術(shù)后肌注青霉素鈉2.0×105IU/只，共3 d，預(yù)防感染。

1.4 給藥 各組均于術(shù)后第2天開(kāi)始灌胃給藥。對(duì)照組、模型組家兔給予蒸餾水，2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組家兔分別給予8%傷科接骨片混懸液和8%麝香接骨膠囊混懸液，3個(gè)YGLS水提取物組家兔分別給予5.2%、10.6%和22.2%YGLS水提取物混懸液，3個(gè)YGLS醇提取物組家兔分別給予3.2%、6.4%和12.8%YGLS醇提取物混懸液。灌胃劑量均為5 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

1.5 觀察指標(biāo) 給藥30 d后心臟取血，1388×g離心10 min，分離血清，測(cè)定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、血磷和血鈣水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取右側(cè)脛骨，X線觀察以評(píng)價(jià)骨折愈合程度，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[2，3]：0分 骨完全連接，無(wú)骨折線可見(jiàn)。1分 骨折斷端邊緣消失；骨膜反應(yīng)密度近似骨影；骨痂填滿缺損，與骨皮質(zhì)密度相同并相互連接。2分 骨折斷端邊緣仍可見(jiàn)，但接近消失；骨膜反應(yīng)較深；骨痂增多，但尚未填滿缺損，密度加深，邊緣較清。3分 骨折斷端邊緣模糊；骨膜反應(yīng)淺淡；骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊。4分 骨折斷端邊緣趨向模糊；骨膜輕度反應(yīng)，無(wú)骨痂可見(jiàn)。組織學(xué)觀察：取骨折斷端及周?chē)浌丘?，?biāo)本置于4%甲醛中固定，甲酸脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察骨痂的變化。

2 結(jié) 果

2.1 YGLS對(duì)兔骨折局部X影像表現(xiàn)的影響 給藥后30 d，模型組家兔脛骨中段可見(jiàn)少量骨痂生長(zhǎng)，但未達(dá)到骨的完全連接，其骨折線、肌肉腫脹并未完全消失。傷科接骨片組家兔脛骨中段骨痂填滿缺損，骨折線隨骨痂骨性愈合而消失，肌肉腫脹消失，骨髓腔復(fù)原，骨折已基本愈合。麝香接骨膠囊組家兔骨折斷端邊緣仍可見(jiàn)，但接近消失；骨痂增多，但尚未填滿缺損，邊緣較清。YGLS水提取物與醇提取物中、高劑量組家兔脛骨中段骨痂填滿缺損，骨折線和肌肉腫脹消失，骨髓腔復(fù)原，骨折基本愈合，各組家兔骨折愈合的等級(jí)見(jiàn)表1。與傷科接骨片一樣，中、高劑量YGLS水提物和醇提物組的等級(jí)明顯低于模型組， 差別有顯著意義 (P<0.05)，即中、高劑量的YGLS水提物和醇提物組家兔骨折修復(fù)快于模型組，表明YGLS水提物和醇提物有一定的促進(jìn)骨折愈合作用。

表1 家兔骨折術(shù)后使用愈骨療傷方30 d的X線片觀察結(jié)果

2.2 YGLS對(duì)骨折局部骨組織結(jié)構(gòu)的影響 傷后30 d，模型組骨折斷端連接部的成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞增生，軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，并伴有軟骨細(xì)胞的變性和空泡化；部分家兔可見(jiàn)初級(jí)骨小梁生成，早期骨痂形成。傷科接骨片陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)骨折處骨小梁明顯增粗，骨痂形成，髓腔通過(guò)；麝香接骨膠囊陽(yáng)性對(duì)照組骨小梁比模型組稍粗，但排列不規(guī)則，有骨痂形成。傷后30 d，YGLS醇提取物與水提取物低劑量組家兔骨折缺損處均可見(jiàn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增生；所形成的骨小梁大多較細(xì)，與模型組相似，均可見(jiàn)早期骨痂形成。YGLS醇提取物與水提取物中劑量組在骨折處均可見(jiàn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增生，并可見(jiàn)軟骨細(xì)胞的核固縮、空泡變性等；骨小梁大多較模型組略粗，有的交互連接成網(wǎng)，但排列不規(guī)則，中央有髓腔通過(guò)，骨痂形成。高劑量醇提取物與水提取物組多數(shù)家兔的骨小梁普遍較模型組增粗，骨小梁相互連接，有髓腔通過(guò)。有少數(shù)家兔可見(jiàn)到軟骨細(xì)胞區(qū)，骨小梁也較成熟，該兩組家兔骨折修復(fù)過(guò)程中形成的骨痂有吸收的趨勢(shì)，呈骨折愈合加快的現(xiàn)象(見(jiàn)圖1)。

2.3 YGLS對(duì)骨折模型兔血清鈣、磷濃度和ALP活性的影響 從表2可見(jiàn)骨折后30 d，與對(duì)照組比較，模型組家兔血清ALP活性和血清鈣磷濃度乘積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，中劑量YGLS水提組與醇提組家兔血清ALP活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量YGLS水提組家兔血清鈣磷濃度乘積顯著升高，與模型組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。高劑量YGLS醇提組家兔血清ALP、鈣濃度、 磷濃度及鈣磷濃度乘積均顯著升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。YGLS水提組與醇提組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。YGLS各組與陽(yáng)性對(duì)照組(傷科接骨片)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 愈骨療傷方對(duì)骨折后30 d各組家兔骨組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×200)

表2 愈骨療傷方對(duì)骨折后30 d家兔血清堿性磷酸酶活性及鈣、磷濃度的影響

Table 2 Effects of Yuguliaoshang recipe on serum alkaline phosphatase activity, the levels of calcium and phosphorus at 30 d after bone fracture in rabbits

表2 愈骨療傷方對(duì)骨折后30 d家兔血清堿性磷酸酶活性及鈣、磷濃度的影響

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與模型組比較；ALP：堿性磷酸酶

ALP(zB/U·L-1)(cB/mmol·L-1)(cB/mmol·L-1)181．00±52．903．38±0．162．24±0．307．57±1．05112．67±31．71＊3．40±0．141．55±0．33＊5．08±1．02＊＊129．00±23．163．56±0．15△1．86±0．546．70±2．17142．00±40．933．48±0．111．43±0．404．99±1．43 131．38±55．923．49±0．211．77±0．416．20±1．63 156．88±37．92△3．54±0．111．76±0．616．28±2．31 162．00±58．84△3．58±0．21△2．00±0．51△7．23±2．19△ 114．25±46．633．37±0．161．71±0．595．77±2．04 146．55±25．86△3．54±0．111．74±0．586．14±2．11 146．13±38．433．54±0．101．94±0．506．84±1．75△

3 討 論

中醫(yī)藥傳統(tǒng)文化博大精深，其通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的綜合作用發(fā)揮治療效果。但傳統(tǒng)的中藥劑型湯劑由于不易保存、攜帶不方便、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。為了更好地發(fā)掘中醫(yī)藥寶庫(kù)，朝著科學(xué)化、現(xiàn)代化道路發(fā)展，必須對(duì)中藥的提取工藝、制備工藝、劑型進(jìn)行改革。傳統(tǒng)中藥劑型湯劑采用水煎煮的方式進(jìn)行提取，但是，在該過(guò)程中存在“黑、大、粗”的問(wèn)題，因此，利用中藥現(xiàn)代化的思路進(jìn)行研究顯得尤為重要。作者在前期研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，考察水提、醇提和超聲提取3種方式，對(duì)方劑中主要有效成分含量的影響[4]。結(jié)果顯示，醇提時(shí)指標(biāo)成分的含量最高。但是，中藥復(fù)方作為整體發(fā)揮作用，單一指標(biāo)成分的高低，不能真實(shí)地反映其在體內(nèi)作用的效果。本研究旨在突破傳統(tǒng)中藥提取工藝評(píng)價(jià)拘泥于“找成分，測(cè)含量”的化學(xué)評(píng)價(jià)模式，采用以藥效學(xué)為核心的評(píng)價(jià)方式，從家兔整體水平，對(duì)水提工藝和醇提工藝進(jìn)行比較。

在臨床觀察骨折愈合的過(guò)程中，多以X線片作為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究亦將X線片列為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。從結(jié)果可見(jiàn)，在相同生藥量(不同的藥物提取量)情況下，中、高劑量醇提組和水提組骨痂填滿缺損，骨折線隨骨痂骨性愈合而消失，表明兩種工藝都能在一定程度上促進(jìn)骨折愈合，且兩者的作用程度相當(dāng)。從病理學(xué)檢查可見(jiàn)，醇提與水提中、高劑量組均可見(jiàn)骨折缺損處有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增生；骨小梁隨著劑量的增加，而呈現(xiàn)逐漸增粗和骨折愈合加快的現(xiàn)象。

由于在骨折愈合的過(guò)程中，成骨細(xì)胞大量增生，其分泌的ALP可以滲透入血清，因此，血清ALP可以作為成骨細(xì)胞活躍性的指標(biāo)，即間接反映骨折愈合的指標(biāo)[5]。另外，骨折愈合必須經(jīng)過(guò)鈣化的過(guò)程，鈣鹽的沉積是關(guān)鍵步驟。血清中鈣、磷的相互作用，促進(jìn)鈣鹽沉積[5，6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取兩者作為評(píng)價(jià)骨折愈合的量化指標(biāo)。從結(jié)果可見(jiàn)，醇提的高劑量組能顯著提高鈣、磷濃度及鈣磷濃度乘積，水提的高劑量組能提高鈣磷濃度乘積。醇提中、高劑量組和水提中劑量組均能提高血清ALP活性。各給藥組之間無(wú)顯著性差異，表明各給藥組對(duì)骨折愈合相關(guān)血液生化指標(biāo)的影響作用相當(dāng)。

從上述研究結(jié)果分析可知，在相同的生藥量下，醇提物和水提物促進(jìn)骨折愈合的作用相當(dāng)。由于醇提和水提的得率不同，導(dǎo)致相同的生藥量下，服用的提取物的量不同。即在相同的作用強(qiáng)度下，醇提能較水提降低約40%的服藥量(醇提的得率為20%，水提的得率為33%)。因此，YGLS以選用醇提工藝為佳。

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