丁立平， 蔡春平， 王丹紅

(1.福清出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建福清350300;2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建福州350001)

氟嗎啉和烯酰嗎啉(見圖1)屬于羧酸酰胺類(carboxylic acid amides，CAAs)真菌殺菌劑，化學(xué)名分別為(E，Z)-4-［3-(4-氟苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰］嗎啉和(E，Z)-4-［3-(4-氯苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙烯酰］嗎啉，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防治卵菌病害，對(duì)甘藍(lán)、番茄等植物的卵菌病害具有優(yōu)良治療作用［1］。其中，氟嗎啉是我國第一個(gè)自主創(chuàng)制、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且商品化的殺菌劑［2］。研究顯示這兩種農(nóng)藥屬于中低毒性殺菌劑，但對(duì)人畜仍具有一定的毒性危害［3，4］。由于烯酰嗎啉已廣泛使用，其殘留水平備受關(guān)注，為此美國、日本和歐盟對(duì)蔬菜中的烯酰嗎啉設(shè)定了最大殘留限量(MRL)，其中歐盟設(shè)定值最嚴(yán)格(0.05 mg/kg)［5］。而氟嗎啉作為我國自主創(chuàng)制的新開發(fā)農(nóng)藥，尚未見對(duì)其設(shè)定最大殘留限量值［6］。

當(dāng)前有關(guān)氟嗎啉和烯酰嗎啉的檢測(cè)主要集中于使用液相色譜［7，8］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［9］。已有的研究中存在液相色譜法檢測(cè)限高，以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器設(shè)備普及率低的問題，為了更好地適應(yīng)蔬菜中這兩種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的需要，亟待開發(fā)出快速、實(shí)用的檢測(cè)方法。王惠云等［10］以及檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［11］使用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜和水果中的烯酰嗎啉殘留，但尚未見同時(shí)檢測(cè)食品中氟嗎啉和烯酰嗎啉殘留的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的報(bào)道或標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 氟嗎啉和烯酰嗎啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of flumorph and dimethomorph

2003 年 Anastassiades等［12］建立了 QuECh-ERS前處理方法，隨著研究的深入該方法不斷發(fā)展，并與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜［13］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜［14］相結(jié)合，在蔬菜、水果、煙草以及肉類等基質(zhì)的農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。此外，該方法在應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求進(jìn)行不同的改進(jìn)。研究表明，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需要對(duì)QuEChERS方法進(jìn)行有效的改進(jìn)可以取得較好的效果［15］。

本研究探索建立了改進(jìn)的QuEChERS前處理方法，在蔬菜中氟嗎啉和烯酰嗎啉殘留檢測(cè)應(yīng)用中取得了較好的前處理凈化效果，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩者的定量和定性分析。此外，本研究對(duì)氟嗎啉和烯酰嗎啉的裂解機(jī)理進(jìn)行了研究，并對(duì)檢測(cè)過程中存在的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;IKA T-25高速分散器，德國IKA公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司;ZM200超離心研磨儀，德國Retsch公司;3K-15冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司;Sartorius BS1100S型分析天平(十萬分之一，德國)。

乙腈、乙酸鈉、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂(分析純)，國藥集團(tuán);中性氧化鋁(48～75 μm)、石墨化碳(GCB)(分析純)，天津 Agela Technologies公司。緩沖鹽組成:Na2SO4和C2H3NaO2質(zhì)量比為4∶1;凈化劑組成:MgSO4、硅膠、GCB 的質(zhì)量比為5∶9∶1;烯酰嗎啉(純度99.0%)和氟嗎啉(純度99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 供試樣品

生姜、番茄、胡蘿卜、菠菜、甘藍(lán)和白木耳樣品均購自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，取可食部分制成糜樣，冷凍保存在-18℃冰箱中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

選擇空白基質(zhì)樣品，使用乙腈進(jìn)行提取，得到空白基質(zhì)提取液。稱量氟嗎啉和烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.0 mg，用乙腈定容至100 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前根?jù)檢測(cè)要求使用空白基質(zhì)提取液稀釋成相應(yīng)濃度的工作溶液。

1.3.2 樣品的提取和凈化

稱取解凍樣品10.0 g于50 mL具塞離心管中，加入 5.0 g緩沖鹽和 20.0 mL乙腈，以 10 000 r/min高速勻漿1 min。另取50 mL離心管，加入20.0 mL的乙腈清洗高速分散器刀頭，然后合并到前一離心管中。合并溶液后的離心管于4 500 r/min離心5 min，上清液全部倒入100 mL雞心瓶中，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加入2.00 mL乙腈定容。稱取0.30 g凈化劑加入5 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入上述上清液1.00 mL，渦旋1 min混勻，于10 000 r/min離心3 min，取上清液并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待分析。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜柱:DB-5 MS毛細(xì)管(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);載氣:高純氦氣(99.999%)，恒流模式，柱流速:1.1 mL/min;進(jìn)樣量:1.00 μL，不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:280℃;柱升溫程序:初始溫度70℃，保持1 min，以20℃/min升至260℃，保持2 min，以5℃/min升至280℃，保持 7 min，以30℃/min升至300℃，保持2 min以去除色譜柱中的殘留雜質(zhì)。

質(zhì)譜電子轟擊離子(EI)源，電子轟擊能量70 eV，單四極桿質(zhì)量分析器;離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;傳輸線溫度:280℃;全掃描(SCAN)模式:掃描范圍m/z 50～550，確定待測(cè)物掃描離子、保留時(shí)間和檢查有無雜質(zhì)干擾;溶劑延遲:15 min;選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式:氟嗎啉定量離子m/z 285，定性離子 m/z 371、165，駐留時(shí)間100 ms;烯酰嗎啉定量離子m/z 301，定性離子m/z 387、165，駐留時(shí)間 100 ms。

1.3.4 工作曲線繪制

將氟嗎啉和烯酰嗎啉的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白基質(zhì)提取液稀釋成 10、20、40、100、1 000 μg/kg 的系列工作溶液，采用外標(biāo)法定量。按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行分析。以工作溶液的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分析物的含量為橫坐標(biāo)(X，μg/kg)繪制工作曲線。

1.3.5 添加回收試驗(yàn)

按照1.3.2節(jié)條件稱取空白樣品并加入適量稀釋的氟嗎啉和烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后靜置2 h，制得加標(biāo)樣品。并按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)進(jìn)行前處理和分析測(cè)試。對(duì)制得的10、20、100 μg/kg的3個(gè)水平的加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定(每個(gè)水平重復(fù)6次)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6 定性與定量離子的選擇

用乙腈配制1.0 mg/L的氟嗎啉和烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)中色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行全掃描。在m/z 50～550范圍得到化合物的全掃描質(zhì)譜圖，結(jié)合所得全掃描質(zhì)譜圖并依據(jù)裂解機(jī)理確定定性和定量離子。

1.3.7 基質(zhì)效應(yīng)的考察

配制質(zhì)量濃度為 10、20、40、100、1 000 μg/L 的氟嗎啉、烯酰嗎啉的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和同樣濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(用乙腈配制)，分別按照1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行測(cè)定，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者斜率的比值 η來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱［17，18］。η ＞1表明基質(zhì)增強(qiáng)，η ＜1 表明基質(zhì)抑制。

1.3.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

在市場(chǎng)上隨機(jī)購買12份蔬菜樣品，分別是胡蘿卜3份、菠菜2份、生姜2份、番茄2份和甘藍(lán)3份，分別按照文獻(xiàn)［11］以及1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)進(jìn)行前處理和分析測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的凈化效果

本文借鑒文獻(xiàn)［15］中的前處理方法，應(yīng)用優(yōu)化的凈化劑組成和用量進(jìn)行前處理。圖2顯示了6種蔬菜基質(zhì)的凈化效果，可見目標(biāo)化合物無干擾峰影響，表明選擇的前處理?xiàng)l件有較好的凈化效果。

2.2 定性和定量離子的確定

在1.3.3節(jié)和1.3.6節(jié)條件下得到氟嗎啉和烯酰嗎啉的全掃描總離子流圖和質(zhì)譜圖，并對(duì)兩者裂解機(jī)理進(jìn)行研究(見圖3)。發(fā)現(xiàn)氟嗎啉和烯酰嗎啉離子具有相似的裂解機(jī)理，都是分子離子發(fā)生α斷裂之后再經(jīng)過消除反應(yīng)(re)得到m/z 165離子。與文獻(xiàn)［6］提供的斷裂機(jī)理進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該文獻(xiàn)中對(duì)氟嗎啉的裂解推斷有待商榷，即文獻(xiàn)［6］未說明裂解機(jī)理并且其推斷的裂解方式不能得到m/z 165的離子碎片。

圖2 生姜、番茄、胡蘿卜、菠菜、甘藍(lán)和白木耳的凈化效果Fig.2 Clean-up effects for ginger，tomato，carrot，spinach，cabbage and tremella samples

圖3 氟嗎啉和烯酰嗎啉的總離子流圖、質(zhì)譜圖和推斷的裂解機(jī)理圖Fig.3 Total ion chromatogram，mass spectra and inferred mechanisms of mass cleavages of flumorph and dimethomorph

2.3 線性關(guān)系、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)

外標(biāo)法定量結(jié)果表明:氟嗎啉和烯酰嗎啉在10～1 000 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。兩種目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限見表1。

2.4 添加回收率

表2結(jié)果顯示，在10、20和100 μg/kg添加水平下，氟嗎啉和烯酰嗎啉的加標(biāo)回收率為71%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8% ～14.7%，結(jié)果符合殘留物分析的要求［16］。

表1 不同基質(zhì)中氟嗎啉和烯酰嗎啉的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)和檢出限(LOD)Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)and limits of detection(LODs)of flumorph and dimethomorph in different matrices

表2 不同樣品中氟嗎啉和烯酰嗎啉的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of flumorph and dimethomorph spiked in different samples(n=6)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)效應(yīng)通常表現(xiàn)為樣品分析液中共流出物改變了分析目標(biāo)物的響應(yīng)值，從而影響定量分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。目前，基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制尚未完全研究清楚，研究人員也嘗試通過各種手段來加以克服［17-19］，歐盟官方推薦使用同種基質(zhì)的工作曲線校正來消除［16］。圖4是根據(jù)2.3節(jié)中不同基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值η繪制的柱狀圖，從中可以看出生姜、番茄和白木耳對(duì)氟嗎啉和烯酰嗎啉具有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而甘藍(lán)則對(duì)二者有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

圖4 6種蔬菜的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of six kinds of vegetables

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法［11］和本方法對(duì)市場(chǎng)購得的12份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明均無氟嗎啉和烯酰嗎啉檢出。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用乙腈高速勻漿提取，以無水硫酸鎂、硅膠和石墨化炭混合物為凈化劑，GC-MS檢測(cè)，外標(biāo)法定量，建立了蔬菜中氟嗎啉和烯酰嗎啉殘留的同時(shí)分析方法。方法方便、快捷、可靠，適用于蔬菜中氟嗎啉和烯酰嗎啉的快速檢測(cè)。

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