李 艷， 徐繼林， 鄭立洋， 李 敏， 嚴(yán)小軍， 駱其君

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211)

羊棲菜，拉丁學(xué)名 Sargasum fusiforme(Hary.)Seichell，屬于圓子綱馬尾藻屬植物，別名鹿角尖、海大麥等。羊棲菜具有抗腫瘤［1］、調(diào)節(jié)免疫功能［2］、降血糖［3］、降血脂［4］、抗凝血［3］、清除體內(nèi)自由基［3，4］等藥理作用，另有研究證明羊棲菜能夠改善海域水質(zhì)環(huán)境［5］。

植物激素在植物體內(nèi)的含量極其小，但對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用［6］。它能夠調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)、各類組織分化、植物成熟與衰敗，還能夠影響植物形態(tài)建成，輔助離體組織培養(yǎng)［7］。對(duì)羊棲菜各部位的植物激素成分含量進(jìn)行分析，不但能夠幫助我們了解羊棲菜生長(zhǎng)發(fā)育周期的各種生理變化，而且可以通過控制羊棲菜生長(zhǎng)發(fā)育過程中外源激素的用量調(diào)控羊棲菜的生長(zhǎng)發(fā)育。

植物激素的檢測(cè)方法主要包括光譜法［8，9］、毛細(xì)管電泳法［10］、電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)法［11］、氣相色譜法［12］、高效液相色譜法［13，14］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等［15-18］。其中光譜法的準(zhǔn)確度較低;毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性較差;電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)法主要局限于檢測(cè)單種植物激素，還有待于進(jìn)一步研究開發(fā);使用氣相色譜法檢測(cè)植物激素的缺點(diǎn)是樣品需要預(yù)先進(jìn)行衍生化處理，一方面步驟繁瑣，另一方面不同的植物激素需要采用不同的衍生化方法，不能同時(shí)檢測(cè)多種植物激素;采用高效液相色譜法檢測(cè)植物激素，解決了氣相色譜法需要衍生化的缺點(diǎn)，但是同時(shí)檢測(cè)多種植物激素時(shí)，在幾種成分保留時(shí)間非常接近的情況下會(huì)出現(xiàn)相互干擾的現(xiàn)象;相比較而言，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是一種更為可靠的分析植物激素的方法。

目前尚未有對(duì)羊棲菜各個(gè)部位的激素含量進(jìn)行全面系統(tǒng)分析的研究。本文建立了一種采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法，對(duì)羊棲菜主分支、側(cè)分支、初生葉、次生葉、莖等5個(gè)部位的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)、異戊烯腺嘌呤［N6-(2-isopentenyl)adenine］、玉米素(zeatin)、異戊烯腺苷［N6-(2-isopentenyl)adenosine］、反式玉米素核苷(trans-zeatin riboside)、獨(dú)角金內(nèi)酯(strigolactone)、水楊酸(salicylic acid)、茉莉酸(jasmonic acid)、脫落酸(abscisic acid)、赤霉素(gibberellin A3)等10種植物激素含量進(jìn)行了分析。該方法便捷、可靠，可以推廣應(yīng)用于同時(shí)分析不同植物的多種植物激素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

美國ThermoFisher Scientific公司TSQ Quantum Access液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng);法國Millipore公司超純水系統(tǒng);國產(chǎn)TP300超聲波清洗機(jī)。

新鮮羊棲菜樣品采集于浙江沿海，包含主分支、側(cè)分支、初生葉、次生葉、莖等5個(gè)部位。標(biāo)準(zhǔn)品吲哚乙酸、異戊烯腺苷、異戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、玉米素、獨(dú)角金內(nèi)酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)購自美國Sigma-Aldrich公司。色譜純甲醇、甲酸、乙酸購自美國Tedia公司;超純水系統(tǒng)自制純水;其他為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 激素提取方法

參照文獻(xiàn)［19，20］的樣品處理方法，準(zhǔn)確稱取新鮮采集的羊棲菜樣品1 g(每組3份平行樣)，冷凍干燥、液氮冰浴研磨后，加入1 mL甲醇/水/甲酸(15∶4∶1，v/v/v)(含 0.5%BHT)，超聲(功率 30 W，頻率40 kHz)提取20 min，放入-20℃冰箱內(nèi)避光浸泡提取16 h，然后在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液置于4 mL棕色樣品瓶中，用0.5 mL 甲醇/水/甲酸(15∶4∶1，v/v/v)(含 0.5%BHT)再提取2次;合并上清液，于35℃下減壓蒸發(fā)至干，用 0.5 mL 甲醇/水/乙酸(90∶10∶0.05，v/v/v)復(fù)溶，于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液供LC-MS分析。每個(gè)樣品平行分析3次，取均值。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

1.3.1 用于正離子掃描模式的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取吲哚乙酸、異戊烯腺嘌呤、玉米素、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷、獨(dú)角金內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg。其中異戊烯腺苷、異戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、玉米素標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇中不易溶解，需先用少量的1 mol/L鹽酸溶解;吲哚乙酸、獨(dú)角金內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品用少量甲醇溶解;將二者混合后用甲醇定容至10.0 mL，配成1 g/L用于正離子掃描模式的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 用于負(fù)離子掃描模式的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取水楊酸、茉莉酸、脫落酸、赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用少量甲醇溶解、定容至10.0 mL，配成1 g/L用于負(fù)離子掃描模式的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)(美國 Thermo Fisher Scientific公司)，流動(dòng)相為水(A)和甲醇(B)。洗脫梯度:20 min內(nèi)B相由15%升到100%，保持5 min;然后B相在1 min內(nèi)降到10%，保持10 min。流速為0.3 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為15 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源電離，在正離子電離模式下噴霧電壓為3 kV，負(fù)離子電離模式下噴霧電壓為2.5 kV;鞘氣壓力為30 L/min;輔助氣流量為2 L/min;離子傳輸毛細(xì)管溫度為300℃，Q2碰撞室碰撞誘導(dǎo)解離電壓為1.5 V，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式掃描;氬氣的碰撞氣壓為0.199 5 Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

按1.4節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè)已提取了植物激素的羊棲菜樣品殘?jiān)?，殘?jiān)袥]有檢出10種植物激素。將該殘?jiān)稍?，? g干燥樣品(每組3個(gè)平行樣)，加入20 μL 1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入1 mL 甲醇/水/甲酸(15∶4∶1，v/v/v)(含 0.5%BHT)，超聲(功率30 W，頻率40 kHz)提取20 min，放入-20℃冰箱內(nèi)避光浸泡提取;分別提取1、8、16、24 h，然后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算目標(biāo)物的回收率，結(jié)果如圖1所示。可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率逐漸提高，但是提取16 h和24 h的回收率變化不大，甚至有個(gè)別植物激素在提取24 h時(shí)其回收率略有降低，這是因?yàn)橹参锛に剌^不穩(wěn)定，提取時(shí)間過長(zhǎng)反而引起部分損失。綜合考慮，選取提取16 h。

圖1 提取時(shí)間對(duì)10種植物激素回收率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the recoveries of the ten phytohormones

2.2 植物激素標(biāo)準(zhǔn)品的LC-MS分析

取1.3節(jié)中配制的10種植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋成1 mg/L的植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，從10種植物激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(見圖2)可以看出，在該LC-MS條件下，10種植物激素互不干擾，能夠得到較好的分離。

以流動(dòng)注射方式對(duì)10種植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行ESI-MS分析，吲哚乙酸、異戊烯腺嘌呤、玉米素、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷、獨(dú)角金內(nèi)酯在正離子模式下主要產(chǎn)生［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰，其m/z分別為 176.0、204.2、220.0、336.1、352.0 和 299.3;水楊酸、茉莉酸、脫落酸和赤霉素在負(fù)離子模式下主要產(chǎn)生［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，m/z分別為137.0、209.0、263.0、345.0。

在SRM模式下獲得10種植物激素的特征碎片離子(見表1)。選取通道1的離子為定量離子，其他離子為輔助定性離子。

圖2 10種植物激素標(biāo)準(zhǔn)品的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖Fig.2 Selected reaction monitoring chromatograms of the ten phytohormone standards

表1 10種植物激素標(biāo)準(zhǔn)品在SRM模式下獲得的特征碎片離子Table 1 Characteristic fragment ions of the ten phytohormone standards obtained by TQMS in SRM mode

2.3 線性范圍與檢出限

用混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制用于正、負(fù)離子掃描模式的系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3次，以目標(biāo)組分定量離子的峰面積平均值(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg/L)進(jìn)行線性回歸分析，得到10種植物激素的線性方程和相關(guān)系數(shù)(r);以信噪比(S/N)為3確定10種組分的檢出限(LOD)，結(jié)果見表2。

表2 10種植物激素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)and limits of detection(LODs)of the ten phytohormones

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

將已提取過植物激素的羊棲菜樣品殘?jiān)稍?，? g干燥樣品，加入質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，按照1.2節(jié)的方法處理樣品，然后按1.4節(jié)的條件進(jìn)行LC-MS分析，計(jì)算得到的加標(biāo)回收率見表3?？梢姺椒ǖ募訕?biāo)回收率在72.24%～91.31%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于6.59%，表明本實(shí)驗(yàn)的可靠性較高。

表3 空白基質(zhì)中10種植物激素的加標(biāo)回收率和RSD(n=3)Table 3 Recoveries and RSDs of the ten phytohormones spiked in blank matrix(n=3)

2.5 羊棲菜各部位激素含量的測(cè)定

按照建立的方法對(duì)羊棲菜5個(gè)部位的10種植物激素含量進(jìn)行了分析，每個(gè)部位樣品測(cè)定3個(gè)平行樣品，取平均值。表4為新鮮羊棲菜5個(gè)部位樣品中10種植物激素含量的檢測(cè)結(jié)果，可以看出，在新鮮樣品中，各種激素的含量范圍為未檢出至4 041.431 ng/g。其中，吲哚乙酸、脫落酸在羊棲菜中總體含量比較高，吲哚乙酸主要分布在羊棲菜的莖中，含量達(dá)到4 041.431 ng/g，脫落酸主要分布在羊棲菜的主分支中，含量達(dá)到1 469.515 ng/g;茉莉酸和水楊酸都是特定環(huán)境刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物激素，這兩種激素在羊棲菜次生葉中含量較高，分別為259.983 ng/g和314.855 ng/g;異戊烯腺苷、異戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷和玉米素都屬于細(xì)胞分裂素，表4中可見羊棲菜各部位異戊烯腺嘌呤的含量均高于異戊烯腺苷，這是因?yàn)樵谥参镏挟愇煜┫佘帐怯坞x態(tài)，異戊烯腺嘌呤是結(jié)合態(tài)。這也驗(yàn)證了植物中結(jié)合態(tài)細(xì)胞分裂素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離態(tài)的細(xì)胞分裂素這一結(jié)論［21］。赤霉素在羊棲菜次生葉及莖中含量較高，它的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)。獨(dú)角金內(nèi)酯是結(jié)構(gòu)形式較新的一類植物激素，主要參與調(diào)控植物側(cè)枝的形成［22-24］，其含量在主分支中最高，達(dá)到534.833 ng/g，其次是在莖中，含量最低是在次生葉中，含量為3.360 ng/g。

表4 羊棲菜5個(gè)部位樣品中10種植物激素的含量Table 4 Contents of the ten phytohormones in five parts of Sargasum fusiforme(Hary.)Seichell

3 結(jié)論

本文建立了一種采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)、電噴霧電離正/負(fù)離子掃描模式同時(shí)分析羊棲菜主分枝、側(cè)分枝、初生葉、次生葉、莖等5個(gè)部位中吲哚乙酸、異戊烯腺苷、異戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、玉米素、獨(dú)角金內(nèi)酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸等10種植物激素含量的方法。該方法的精密度良好，可靠性較高，可以用于同時(shí)分析多種植物激素。

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