黃冬梅， 黃宣運(yùn)， 顧潤潤， 惠蕓華， 田良良， 馮 兵， 張 璇， 于慧娟

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090)

磺胺類(sulfonamides，簡稱SAs)是指具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱?；前奉愃幬飳Ω锾m氏陽性菌和一些革蘭氏陰性菌有顯著的治療作用，能治療水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用較為普遍。過量使用磺胺類藥物會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品中存在藥物殘留，人們食用這些水產(chǎn)品后就可能造成體內(nèi)藥物蓄積，對人體健康產(chǎn)生危害。SAs能破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血癥、粒細(xì)胞缺乏癥和血小板減少癥等，同時(shí)具有潛在的致畸、致癌或致突變作用［1］。因此磺胺類藥物在生物體中的殘留情況日益受到關(guān)注。日本將磺胺喹噁啉、磺胺二甲基嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶和磺胺嘧啶列為動(dòng)物性食品重點(diǎn)監(jiān)控的藥物，規(guī)定磺胺二甲基嘧啶的最大殘留限量為10 μg/kg。美國規(guī)定泌乳牛禁用磺胺二甲基嘧啶等。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定所有動(dòng)物食品中磺胺類藥物總量不超過100 μg/kg的最大殘留限量值［2］。近幾年我國加強(qiáng)了對養(yǎng)殖水產(chǎn)品中磺胺類藥物的抽檢力度，以確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

國內(nèi)外磺胺類藥物的殘留檢測方法包括酶聯(lián)免疫 法［3-5］、安 培 檢 測 法［6］、高 效 液 相 色 譜 法(HPLC)［7-14］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15-18］等。目前較為常用的是高效液相色譜-熒光檢測法和紫外檢測法，以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。張小軍等［19］利用液相色譜-熒光檢測法測定水產(chǎn)品中4種磺胺類藥物，使用熒光胺作為柱前衍生試劑，檢出限(LOD)僅為 10 μg/kg。Sílvia 等［20］也采用熒光胺柱前衍生法對動(dòng)物飼料中的8種磺胺進(jìn)行測定，熒光反應(yīng)于暗處室溫下反應(yīng)2 h，不同動(dòng)物飼料中的LOD為10～100 μg/kg。而配有紫外檢測器的液相色譜法的檢測靈敏度更低，盧坤等［21］采用高效液相色譜-紫外檢測法測定蜂蜜中5類抗生素，磺胺類藥物的定量限(LOQ)為33.27 ～40.13 μg/kg，同時(shí)液相色譜-紫外檢測法通常采用選擇性較低的190 nm或270 nm的紫外波長檢測，會(huì)有低吸收波長的雜質(zhì)化合物干擾目標(biāo)化合物的分離，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度較高，張海琪等［22］利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大黃魚中20種磺胺類藥物殘留，LOQ均能達(dá)到5.0 μg/kg，但是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀較昂貴，使用成本高。

本研究建立了水產(chǎn)品中磺胺類殘留檢測的在線柱后衍生液相色譜法，磺胺類藥物經(jīng)色譜柱分離后，在柱后衍生系統(tǒng)中與熒光胺(fluorescamine)反應(yīng)，相比柱前衍生提高了衍生反應(yīng)速度，縮短了檢測時(shí)間，反應(yīng)生成具有專一熒光特性的化合物，用熒光檢測器定性定量分析，可明顯消除雜質(zhì)干擾;同時(shí)本文對衍生反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提高了檢測響應(yīng)值，使14種磺胺類藥物的定量限達(dá)到1.0～5.0 μg/kg，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度接近。該方法的建立可以提供靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的蝦中磺胺類藥物的多殘留測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有熒光檢測器，PCX型柱后衍生系統(tǒng)(美國Pickering Vector公司);CF16RXⅡ型離心機(jī)(日本Hitachi公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);漩渦混合器(德國IKA公司);超聲波清洗器(美國Branson公司);Milli-Q超純水裝置(Millipore公司)。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺(sulfanilamide，SN)、磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)、磺胺噻唑(sulfathiazole，ST)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SM1)、磺胺-5-甲氧嘧啶(sulfameter，SMD)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SM2)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine，SMP)、磺胺氯噠嗪 (sulfachlorpyridazine，SCP)、磺胺-6-甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine，SMM，純度 98.5%)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，SMZ)、磺胺多辛(sulfadoxine，SDM')、磺 胺 二 甲 異 噁 唑 (sulfisoxazole，SXZ)、磺胺二甲氧噠嗪(sulfadimethoxine，SDM)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline，SQ，純度98.0%)、磺胺吡啶(sulfapyridine，SP，內(nèi)標(biāo))均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司(未標(biāo)注純度的標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥99.0%，);甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯為色譜級試劑(美國Tedia公司);熒光胺(純度≥98.0%，美國Sigma公司);乙酸、鹽酸、乙酸鈉(分析純，國藥化學(xué)試劑公司);微孔濾膜(0.45 μm，上海安譜科學(xué)儀器公司);超純水(18.2 MΩ·cm)。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取各磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解，配制成以下質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，磺胺 8 mg/L、磺胺嘧啶 16 mg/L、磺胺噻唑 16 mg/L、磺胺甲基嘧啶16 mg/L、磺胺-5-甲氧嘧啶40 mg/L、磺胺二甲基嘧啶16 mg/L、磺胺甲氧噠嗪40 mg/L、磺胺氯噠嗪40 mg/L、磺胺-6-甲氧嘧啶40 mg/L、磺胺甲噁唑40 mg/L、磺胺多辛40 mg/L、磺胺二甲異噁唑40 mg/L、磺胺二甲氧噠嗪40 mg/L、磺胺喹噁啉40 mg/L。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，用甲醇稀釋并定容至100 mL。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取磺胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)品8 mg，用甲醇溶解定容至100 mL。溶液濃度為80 mg/L。取2.5 mL，用乙酸乙酯稀釋并定容至100 mL，溶液質(zhì)量濃度2 mg/L。

2%乙酸溶液:量取20 mL乙酸，加水至1 000 mL;0.2 g/L熒光胺溶液:稱取0.04 g熒光胺，加入100 mL乙腈溶解，再加入20 mL甲醇和80 mL乙酸溶液混勻，保存在棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配;2 mol/L鹽酸溶液:量取180 mL鹽酸，加水至1 000 mL;3.5 mol/L乙酸鈉溶液:稱取28.7 g無水乙酸鈉，加水溶解并稀釋至100 mL;乙腈、甲醇、乙酸鈉混合溶液:準(zhǔn)確移取20 mL乙酸鈉溶液、5 mL乙腈和5 mL甲醇混合。

凡納濱對蝦、青蝦、羅氏沼蝦為購自上海市農(nóng)貿(mào)市場的養(yǎng)殖水產(chǎn)品。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL;柱溫:40℃;激發(fā)波長:450 nm;發(fā)射波長:495 nm;流動(dòng)相:A為乙腈，B為甲醇，C為2%的乙酸溶液;梯度洗脫程序?yàn)?～15 min，5%A，10%B;15～30 min，5%A～20%A，10%B;30～40 min，20%A，10%B;40～45 min，20%A～5%A，10%B;45～55 min，5%A，10%B。

1.2.2 柱后衍生系統(tǒng)條件

熒光胺衍生試劑質(zhì)量濃度:0.2 g/L;衍生試劑流速:0.15 mL/min;反應(yīng)器溫度:50℃。

1.3 樣品前處理

提取:蝦去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分絞碎。稱取(10.00±0.05)g樣品于50 mL離心管中，加入磺胺吡啶內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，加入25 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩提取5 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將提取溶液轉(zhuǎn)入雞心瓶中;殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ偬崛∫淮?合并提取液，于40℃減壓濃縮至約1 mL。

凈化:將雞心瓶中的液體轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，用4 mL乙酸乙酯洗雞心瓶，溶液合并至離心管中，在離心管中精確加入2.00 mL鹽酸溶液，漩渦混合1 min，3 000 r/min離心5 min，去除上層溶液。在離心管中加入5 mL正己烷，漩渦混合1 min，3 000 r/min離心5 min，移去正己烷層。將離心管中溶液過0.45 μm 水相濾膜，取200 μL濾液于進(jìn)樣瓶中，加入300 μL乙腈、甲醇、乙酸鈉混合溶液，混勻1 min，供高效液相色譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法條件的研究

2.1.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

內(nèi)標(biāo)法校正可消除由于測試條件的波動(dòng)而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響。在痕量物質(zhì)檢測中內(nèi)標(biāo)法的使用較為普遍。選擇內(nèi)標(biāo)物時(shí)要求在待測試樣中不存在該化合物，同時(shí)內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)與待測組分的性質(zhì)相近，并且在色譜圖上能彼此分開?；前愤拎ね瑢儆诨前奉愃幬铮谖r類養(yǎng)殖中不使用該種物質(zhì)，在圖1中可看出能與待測組分完全分開，不干擾待測物的出峰，因此將磺胺吡啶確定為本方法的內(nèi)標(biāo)物。

2.1.2 前處理方法的確定

本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈和乙酸乙酯作為提取劑，比較提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈對磺胺等幾種藥物的提取效率低;此外，由于乙腈與水互溶，提取時(shí)將水溶性雜質(zhì)一并提取出來，不僅在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時(shí)難以蒸發(fā)，而且提取液中雜質(zhì)較多影響下一步的凈化;因此采用與水不互溶的乙酸乙酯作為提取劑。不同提取試劑對回收率的影響見表1。

表1 不同提取試劑對磺胺回收率的影響(n=5)Table 1 Influences of different extraction reagents on recoveries of the sulfonamides(n=5)

常用的樣品凈化方法為液液萃取凈化和固相萃取柱凈化等?；前奉愃幬锝Y(jié)構(gòu)中有磺酸基和氨基，可以采用磺酸基陽離子固相萃取柱凈化的方法。劉海新等［14］使用磺酸基陽離子固相萃取小柱(500 mg/3 mL)進(jìn)行凈化，將提取液蒸發(fā)濃縮后與5 mL乙腈-二氯甲烷(4∶6，v/v)混勻，過柱后用乙腈-二氯甲烷清洗蒸發(fā)瓶并過固相萃取柱，再用5 mL乙腈、3 mL水洗滌小柱，氮?dú)獯蹈珊笥靡宜嵋阴?甲醇-氨水(50∶45∶5，v/v/v)將磺胺類藥物洗脫下來，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?。過柱凈化時(shí)間較長，操作步驟復(fù)雜。因此本工作利用磺胺類藥物易溶于鹽酸溶液的性質(zhì)，采用液液萃取的方式，在反萃取時(shí)將蝦中的脂溶性雜質(zhì)保留在上層乙酸乙酯和正己烷層中去除，從而達(dá)到凈化下層水相的目的。

磺胺類物質(zhì)難溶于水，可溶于甲醇、乙醇等有機(jī)試劑。其藥物分子中既有芳香第一胺(呈弱堿性)，又有磺酰氨基(顯弱酸性)，因此磺胺類藥物呈酸堿兩性，可與酸或堿成鹽而溶于水。因涉及下一步驟的去脂，必須將磺胺類藥物保留在水相中才能用正己烷去脂，因此選擇2 mol/L的鹽酸溶液將磺胺類物質(zhì)從乙酸乙酯層中反萃取出來，將磺胺類物質(zhì)保留在鹽酸溶液中。

磺胺類藥物的上機(jī)溶液通常選擇甲醇水溶液、乙腈水溶液或流動(dòng)相，由于本方法中過水相濾膜后的濾液為2 mol/L的鹽酸溶液，酸性較強(qiáng)，必須加入弱堿性的乙酸鈉溶液降低溶液的酸性，否則上機(jī)液酸性過強(qiáng)會(huì)影響色譜峰峰形，給定量帶來誤差，同時(shí)濾液中加入有機(jī)相乙腈和甲醇，與流動(dòng)相保持一致，可以改善峰形，使保留時(shí)間更穩(wěn)定。

2.1.3 儀器條件的優(yōu)化

選擇HPLC較為常用的C18柱作為色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種磺胺類化合物在Agilent SB-C18色譜柱上能獲得理想的分離效果。

磺胺類化合物極性差異較大，采用等度洗脫很難將多組分磺胺類化合物同時(shí)分離，而采用梯度洗脫方式可以較好地解決這一問題。在梯度洗脫初始階段以低比例有機(jī)相作為流動(dòng)相，將極性較強(qiáng)的組分先洗脫出來，隨后逐漸增加有機(jī)相比例，使非極性強(qiáng)的組分逐一流出色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)了磺胺類藥物的有效分離。同時(shí)根據(jù)磺胺類化合物具有弱堿性的性質(zhì)，在流動(dòng)相中加入一定的酸性物質(zhì)(2%乙酸)，會(huì)促進(jìn)磺胺類藥物的電離，有助于色譜柱內(nèi)硅膠硅醇基的質(zhì)子化，消除硅醇基與磺胺之間的相互作用，減少峰拖尾，改善了磺胺的色譜峰形和分離效果?；前奉愃幬镌陉幮晕r樣品中的加標(biāo)色譜圖見圖1。

2.1.4 柱后衍生系統(tǒng)參數(shù)的選擇

柱后衍生系統(tǒng)的參數(shù)條件設(shè)置決定磺胺類化合物的儀器響應(yīng)值，對方法的靈敏度影響很大，因此必須對參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了熒光胺溶液濃度、試劑流速和反應(yīng)溫度這3個(gè)參數(shù)。14種磺胺類藥物的變化趨勢基本一致，將其中8種磺胺的結(jié)果繪成曲線，結(jié)果見圖2?；前奉惢衔锏拿娣e響應(yīng)值隨著熒光胺溶液濃度的增加而增長，但是熒光胺濃度過高時(shí)會(huì)有析出，沉積在儀器上而對儀器造成損傷，因此確定0.2 g/L為本實(shí)驗(yàn)熒光胺溶液的質(zhì)量濃度，在此濃度下化合物的靈敏度已能滿足檢測要求。當(dāng)衍生化試劑流速達(dá)到0.15 mL/min時(shí)，峰面積達(dá)到最高。在反應(yīng)溫度達(dá)到40～50℃時(shí)，反應(yīng)趨穩(wěn)，響應(yīng)值變化不大，因此將50℃確定為實(shí)驗(yàn)溫度。

圖1 空白蝦樣品中添加5 μg/kg磺胺類藥物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the sulfonamides spiked in a blank shrimp sample

圖2 熒光胺溶液的(a)濃度、(b)流速和(c)反應(yīng)溫度對磺胺類藥物峰面積的影響Fig.2 Influence of(a)mass concentration，(b)flow rate of fluorescamine solution and(c)reaction temperature on the peak area of the sulfonamides

2.2 方法有效性研究

2.2.1 方法線性范圍及檢出限、定量限

本實(shí)驗(yàn)的校準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)標(biāo)樣添加法繪制，即在10 g空白蝦樣品中添加磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025、0.1、0.25、0.5、1 mL 和內(nèi)標(biāo)使用液50 μL，按1.3節(jié)方法操作，取50 μL注入高效液相色譜儀中，按以上儀器條件進(jìn)行分析，以磺胺類化合物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，對應(yīng)待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，得到校準(zhǔn)曲線，14種磺胺類藥物在5～200 μg/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

在空白蝦樣品中分別添加磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比(S/N≥3)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的檢出限，以10倍信噪比(S/N≥10)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法的定量限?；前奉愃幬锏木€性回歸方程以及檢出限、定量限見表2。

表2 14種磺胺類藥物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear regression equations，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of the 14 sulfonamides

2.2.2 方法的回收率與精密度

在空白蝦樣品中分別添加3個(gè)水平的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣。測定結(jié)果顯示，平均添加回收率為77.8%～103.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9% ～9.1%，具體數(shù)據(jù)見表3。

2.3 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用本方法對購于上海市農(nóng)貿(mào)市場的凡納濱對蝦、青蝦和羅氏沼蝦樣品進(jìn)行了14種磺胺類藥物的檢測，60個(gè)樣品中均未檢出磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺二甲異噁唑、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺喹噁啉。但是磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲噁唑有檢出:在2個(gè)凡納濱對蝦樣品中檢出了磺胺二甲基嘧啶，含量分別為16.4 μg/kg和12.1 μg/kg;在1個(gè)青蝦樣品中檢出了磺胺甲噁唑，含量為42.5 μg/kg;但這3個(gè)樣品中磺胺類藥物的總量均在國家規(guī)定的100 μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，為合格樣品。

表3 蝦空白樣品中添加磺胺類藥物的平均回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the SAs in black shrimp samples(n=6)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

3 結(jié)論

本研究利用磺胺類藥物與熒光胺反應(yīng)產(chǎn)生熒光基團(tuán)的性質(zhì)，建立了蝦中14種磺胺類藥物殘留量的在線柱后衍生高效液相色譜分析方法。該法衍生反應(yīng)效率較高，樣品凈化效果較好，待測物色譜圖不存在雜峰干擾，靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確。14種磺胺類藥物的定量限為1.0～5.0 μg/kg，能滿足國內(nèi)外對磺胺類藥物的限量要求，適用于蝦中痕量磺胺類藥物的多殘留檢測。

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