楊占輝 史言妍 高亦珂 張啟翔

(北京林業(yè)大學，北京，100083)

喜鹽鳶尾和黃菖蒲種間雜交障礙1)

楊占輝 史言妍 高亦珂 張啟翔

(北京林業(yè)大學，北京，100083)

以喜鹽鳶尾(IrishalophilaPall)和黃菖蒲(I.pseudocorusL.)2種觀賞鳶尾植物為材料進行種間雜交，并對二者花粉活力、花粉管行為、胚胎發(fā)育及雜交障礙等進行研究。結果表明：受精后障礙是導致喜鹽鳶尾和黃菖蒲雜種敗育的主要原因，表現(xiàn)為雜種胚在合子早期敗育。正反交組合常規(guī)授粉后均未得到果實，且均存在一定程度的受精前障礙，喜鹽鳶尾×黃菖蒲授粉后48 h花粉管內(nèi)有大量栓塞，黃菖蒲×喜鹽鳶尾授粉后2 h柱頭上出現(xiàn)少量胼胝質(zhì)，但最終均有少量花粉管成功伸入胚珠；對胚胎發(fā)育的觀察發(fā)現(xiàn)，喜鹽鳶尾×黃菖蒲和黃菖蒲×喜鹽鳶尾雜種胚和胚乳的降解分別發(fā)生在授粉后9～15 d和15～21 d；授粉后6 d是黃菖蒲×喜鹽鳶尾幼胚拯救較適宜的時期，此時，通過子房培養(yǎng)法于MS+2.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上獲得了膨大的胚珠并發(fā)育為種子。

鳶尾屬；種間雜交；雜交障礙；胚拯救

鳶尾屬(IrisL.)植物普遍具有較高的觀賞價值，特別是在北美和歐洲已被廣泛應用于園林配植中，遠緣雜交是培育鳶尾新品種的有效手段[1-2]。目前國外已經(jīng)獲得了一些無髯鳶尾種間雜種[3-6]。Yabuya et al.[7]在對溪蓀(I.sanguinea)和燕子花(I.laevigata)正反交胚胎學研究后，發(fā)現(xiàn)胚乳退化導致了雜種胚的敗育，并通過幼胚拯救成功獲得了燕子花×玉蟬花(I.ensata)的雜種后代[4]，之后又用燕子花與玉蟬花做親本獲得了具有高花粉活性和種子活力的雙二倍體[8]。2006年，Inoue et al.[6]通過幼胚拯救獲得暗黃鳶尾(4x)(I.fulva)×燕子花雜交種。我國鳶尾屬植物種質(zhì)資源豐富，但育種起步較晚[9]。周永紅等[10]將雞冠狀亞屬的扁竹蘭(I.confuse)和蝴蝶花(I.japonica)雜交，獲得雜種后代。黃蘇珍等[11]進行了鳶尾亞屬內(nèi)6個組合的種間雜交試驗，結實率僅為2.1%，最終雜種苗全部死亡。畢曉穎等[12]分別用0.1% 6-BA處理柱頭后授粉以及提前授粉的方式僅獲得了馬藺(I.lactea)和溪蓀正反交的有胚種子。目前，除野鳶尾(I.dichotoma)和射干(I.domestica)[13]外，國內(nèi)仍未有獲得其他無髯鳶尾種間雜種的報道。

喜鹽鳶尾(I.halophilaPall.)和黃菖蒲(I.pseudacorusL.)分屬鳶尾屬琴瓣鳶尾亞屬和無附屬物亞屬，前者耐旱、抗寒、耐鹽堿，但花朵較小；后者耐水濕，花大色艷但花色單一。進行二者雜交育種，有望培育耐旱同時耐水濕的園林植物。本研究通過對花粉活力的測定以及花粉管行為的觀察，并進一步深入，對雜種進行胚胎學觀察及幼胚拯救，為改良喜鹽鳶尾的觀賞性狀、獲得觀賞性與抗性俱佳的雜種后代奠定理論基礎。

1 材料與方法

雜交試驗：2012年5月份，分別以喜鹽鳶尾和黃菖蒲為父母本，開花前1 d去垂瓣和花藥，并對父本花朵進行套袋，次日上午進行常規(guī)雜交。分別配置喜鹽鳶尾和黃菖蒲的自交和正反交組合，試驗在露地苗圃進行。

親本花粉活力測定：采用TTC法及萌發(fā)法測定花粉活力。萌發(fā)法采用25 ℃條件下光照培養(yǎng)12 h，每處理3次重復，每重復觀察3個視野，以花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標準。采用的培養(yǎng)基：蔗糖15%+硼酸150 mg·L-1+氯化鈣10 mg·L-1。

發(fā)芽率=(已萌發(fā)的花粉粒數(shù)目/花粉粒總數(shù))×100%。

花粉管行為熒光觀察：授粉后2、6、12、24、48 h采集3朵花的花柱和子房，卡諾固定液(V(乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)固定3 h，后轉(zhuǎn)移至70%酒精中，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｋ苄员桨匪{(苯胺藍以0.1%的比例溶于0.1N K3PO4)染色后，于Nikon熒光顯微鏡下觀察。

雜種胚胎發(fā)育過程觀察：采集授粉后3、6、9、15、21、27、33 d的3個子房，F(xiàn)AA固定液(V(50%酒精)∶V(冰醋酸)∶V(福爾馬林)=89∶6∶5)固定。采用常規(guī)石蠟切片方法觀察雜種胚胎發(fā)育過程。

雜種幼胚拯救：采集授粉后6、9、12 d的子房，常規(guī)方法進行消毒處理，無菌條件下取胚珠，接種到MS培養(yǎng)基以及MS+2.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上進行胚珠培養(yǎng)，每處理12瓶，每瓶20個胚珠。授粉后6 d的子房同時采用胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的方法來進行幼胚拯救，子房培養(yǎng)時切除子房外壁后再接種到培養(yǎng)基上。

2 結果與分析

2.1 親本花粉活力測定

喜鹽鳶尾新鮮花粉的TTC染色率為84.63%，萌發(fā)率為59.90%，測定結果一致性較好，表明兩種方法均適宜測定喜鹽鳶尾的花粉活力。黃菖蒲花粉的萌發(fā)率為8.56%，遠低于TTC染色率96.55%；黃菖蒲自交結實率為90%(表1)，表明其新鮮花粉活力良好，因此，TTC染色結果相對較準確地反映了其花粉生活力狀況。

2.2 喜鹽鳶尾和黃菖蒲種間雜交及自交結實性的比較

由表1可知，喜鹽鳶尾和黃菖蒲自交結實率分別為50%和90%，而正反交組合均未結實。觀察發(fā)現(xiàn)，無論正交還是反交組合，均有20%左右的子房在授粉后3 d內(nèi)即干枯脫落，表現(xiàn)為迅速敗育；雖有少數(shù)子房授粉后發(fā)育膨大，平均果長有所增加，但果實寬度卻明顯小于同時期親本自交正常發(fā)育的果實，這些子房甚至在授粉后40 d內(nèi)均可保持綠色，此時將其切開，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部胚珠干癟無光澤。授粉后60 d左右，外壁維持綠色的子房也相繼脫落敗育。

表1 喜鹽鳶尾和黃菖蒲正反交及自交結實性比較

2.3 喜鹽鳶尾和黃菖蒲正反交及自交花粉管行為觀察

對照組喜鹽鳶尾自交2 h后花粉大量萌發(fā)，花粉管伸至花柱的1/4～1/3處，6 h花粉管伸至4/5處，12 h花粉管伸至花柱底部，24 h花粉管伸入子房，48 h花粉管進入胚珠(圖1A)。黃菖蒲自交2 h后花粉在柱頭上開始萌發(fā)，24 h花粉管伸到花柱底部，進入子房，48 h花粉管伸入胚珠(圖1E)；在正反交組合中均觀察到一定程度的受精前障礙。喜鹽鳶尾×黃菖蒲授粉后6 h才有少量花粉開始萌發(fā)，并發(fā)現(xiàn)柱頭上有胼胝質(zhì)沉積，12 h花粉管伸長，但未伸入花柱，48 h花粉管伸入子房，花粉管內(nèi)有大量栓塞(圖1B)，有少量花粉管伸入胚珠(圖1C)。總體上，花粉萌發(fā)速度和花粉管伸長行為都滯后于對照組。

黃菖蒲×喜鹽鳶尾授粉后2 h花粉開始萌發(fā)，柱頭上出現(xiàn)少量胼胝質(zhì)，6 h花粉管伸到花柱的1/2處，12 h已有少量花粉管伸至花柱底部，24 h花粉管進入子房，48 h少量花粉管伸入胚珠(圖1D)，但花粉管內(nèi)有大量栓塞?；ǚ酃苄袨榕c喜鹽鳶尾自交較相似。

A.喜鹽鳶尾?，48 h，花粉管伸入胚珠；B.喜鹽鳶尾×黃菖蒲，48 h，花粉管內(nèi)有大量栓塞；C.喜鹽鳶尾×黃菖蒲，48 h，花粉管伸入胚珠；D.黃菖蒲×喜鹽鳶尾，48 h，花粉管伸入胚珠；E.黃菖蒲?，48 h，花粉管伸入胚珠；箭頭指示關鍵點。

圖1 喜鹽鳶尾和黃菖蒲正反交及自交授粉后花粉管生長情況

2.4 雜種胚胎發(fā)育過程觀察

喜鹽鳶尾×黃菖蒲在授粉3～9 d發(fā)育正常，授粉后15 d胚乳和胚退化完全，珠心細胞退化成帶狀痕跡，授粉27 d珠心細胞完全退化，內(nèi)珠被退化成帶狀痕跡，外珠被大部分也已退化。授粉33 d后內(nèi)外珠被都退化成帶狀痕跡(圖2，A-E)。

黃菖蒲×喜鹽鳶尾在授粉3～15 d發(fā)育正常，原胚周圍游離一些胚乳核，21 d胚和胚乳已退化，珠心大部分解體，27 d珠心全部解體，內(nèi)珠被退化成帶狀痕跡，授粉33 d后外珠被也退化成帶狀痕跡(圖2，F(xiàn)-I)。

因此，上述結果與雜交情況和授粉后蒴果實際發(fā)育表現(xiàn)一致，表明不親和障礙主要發(fā)生在受精后。

A-E.喜鹽鳶尾×黃菖蒲，A.3 d,B.9 d,C.15 d,D.21 d,E,33 d；F-I.黃菖蒲×喜鹽鳶尾，F(xiàn).9 d,G.15 d,H,21 d,I.33 d；MP.珠孔端；EM.原胚；EN.游離胚乳核；NU.珠心；II.內(nèi)珠被；OI.外珠被。

圖2 喜鹽鳶尾和黃菖蒲正反交胚胎發(fā)育過程

2.5 雜種幼胚拯救

黃菖蒲×喜鹽鳶尾授粉后9 d的雜種胚胎石蠟切片觀察結果表明發(fā)育正常，但此時觀察到雜種果實的平均寬度已明顯小于黃菖蒲自交組合，預示部分雜種胚胎敗育已經(jīng)開始，綜合考慮后，對黃菖蒲×喜鹽鳶尾幼胚拯救設定了3個時間點：授粉后6、9、12 d(圖3A)。

授粉后6 d幼胚拯救采用了胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)2種方式(表2)。去除子房外壁的子房切片內(nèi)部分胚珠膨大發(fā)育(圖3B)，最后得到3粒種皮黑色且有光澤的種子(圖3C)，但培養(yǎng)3個月之后逐漸干癟，并未萌發(fā)。

授粉后9 d和12 d的胚珠分別接種在2種培養(yǎng)基上(圖3D)，1個月之后，2種培養(yǎng)基上的胚珠均未膨大，但接種在MS+2.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上外觀保持綠色的胚珠要明顯多于同時期接種在MS培養(yǎng)基上的數(shù)目，表明MS+2.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基要優(yōu)于MS培養(yǎng)基。

表2 黃菖蒲×喜鹽鳶尾雜種胚拯救

所有時期接種的胚珠均未萌發(fā)，接種后3個月內(nèi)逐漸褐化并最終全部死亡。

3 結論與討論

花粉是否具有生命力是確保雜交成功的一個重要條件，因此，雜交之前有必要對親本的花粉生命力進行測定。萌發(fā)法是測定花粉活力的常規(guī)方法，TTC法則可以迅速且較精確地反映花粉活性[14]。本試驗采取2種方法測定親本活力，喜鹽鳶尾的測定結果較一致；黃菖蒲新鮮花粉的萌發(fā)率很低，但其自交又具有良好結實率，表明花粉是具有良好活力的，之所以僅少數(shù)花粉萌發(fā)，可能是由于培養(yǎng)液成分不能很好滿足其萌發(fā)所需條件。花粉活力與遺傳和環(huán)境有關[14]，因此，適宜的培養(yǎng)液成分需進一步篩選。

A.黃菖蒲×喜鹽鳶尾授粉后9 d的子房；B.子房切片培養(yǎng)授粉后6 d的子房得到膨大胚珠；C.膨大胚珠發(fā)育為黑亮的種子;D.胚珠接種。

鳶尾遠緣雜交不親性主要表現(xiàn)為受精前障礙和受精后雜種胚敗育[3，12-13]。畢曉穎等[12]發(fā)現(xiàn)馬藺和溪蓀正反交不親和原因主要發(fā)生在受精前。野鳶尾和射干正反交雜交障礙存在差異，野鳶尾×射干不親和障礙主要發(fā)生在受精前，而反交組合不親和主要由受精后胚敗育導致[13]。而在本研究中，花粉管行為及雜種胚胎發(fā)育觀察結果表明，喜鹽鳶尾×黃菖蒲和黃菖蒲×喜鹽鳶尾雖然存在一定的受精前障礙，降低了雜交親和性，但最終成功受精，而雜種胚和胚乳的退化則直接導致雜種的徹底敗育。因此，喜鹽鳶尾和黃菖蒲正反交雜種敗育的主要障礙存在于受精后。

幼胚拯救的方法是克服遠緣雜交受精后障礙的有效途徑[15]，根據(jù)培養(yǎng)對象的不同，又分為子房培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)[16]。通過幼胚拯救獲得遠緣雜種已經(jīng)在某些植物中得以實現(xiàn)[17]，而在鳶尾屬植物種間雜交育種中也有成功案例，如：Yabuya et al.[3]通過幼胚拯救獲得了屬內(nèi)種間雜交組合燕子花×玉蟬花的雜種后代。本試驗采用胚珠培養(yǎng)接種的所有時期的胚珠均未萌發(fā)，接種后3個月內(nèi)全部褐化并死亡，其原因可能與婁琦[18]推測一致，即胚珠從子房中摘除后不能叢胎座上吸取營養(yǎng)，因而不能正常生長分化，進而死亡。因此，建議采取去除子房外壁的子房切片的培養(yǎng)方式。雖然未能通過胚珠培養(yǎng)獲得黃菖蒲×喜鹽鳶尾的雜種，對其授粉后6 d的雜種子房進行幼胚拯救后，得到發(fā)育膨大的胚珠，并發(fā)育為具有正常外觀的種子。將種子離體培養(yǎng)3個月后逐漸萎縮干癟，可能是種子內(nèi)部自身發(fā)育不完善造成其不能正常萌發(fā)而最終死亡，這也從側面反映了導致黃菖蒲×喜鹽鳶尾敗育的主要障礙發(fā)生在受精后。因此，認為授粉后6 d是黃菖蒲×喜鹽鳶尾幼胚拯救較適宜的時期，進一步深化研究有可能克服喜鹽鳶尾和黃菖蒲種間雜交障礙，獲得雜種苗。

[1] Yabuya T. Chromosome associations and crossability withIrisensataThunb. in induced amphidiploids ofI.laevigataFisch.×I.ensata[J]. Euphytica,1991,55:85-90.

[2] Yabuya T, Noda T. The characterization of autoallotetraploid hybrids betweenIrisensataThunb. andI.laevigataFisch[J]. Euphytica,1998,103(3):325-328.

[3] Yabuya T, Yamagata H. Elucidation of seed failure and breeding of F1 Hybrid in reciprocal crosses betweenIrisensataThunb. andI.leavigataFisch[J]. Japan J Breed,1980,30(2):139-150.

[4] Tomino K, Sakurai O. Cross betweenIrispesudacorusL. andI.ensataThunb. var.ensta[J]. Bull Fac Edu Mie Univ，1972(23):17-26.

[5] Graeme G. Iris flower of the rainbow[M]. Australia: Kangaroo Press,1997：9-202.

[6] Inoue K, Kato K, Nobukuni A, et al. Characterization of tetraploid plants regenerated via protoplast culture of Iris fulva and their crossability with Japanese irises[J]. Scientia Horticulturae,2006,110(4):334-339.

[7] Yabuya T, Yamagata H. Embryological and cytological studies on seed development after reciprocal crosses betweenIrissanguineaHornem. andI.leavigataFisch[J]. Japan J Breed,1978,28(3):211-224.

[8] Yabuya T. Amphidiploids betweenIrislaevigataFisch. andI.ensataThunb. induced through in vitro culture of embryos treated with colchicine[J]. Japan J Breed,1985,35:136-144.

[9] 郭晉燕,張金政,孫國峰,等.根莖類鳶尾園藝學研究進展[J].園藝學報,2006,33(5):1149-1156.

[10] 周永紅,伍碧華,顏濟,等.Irisjaponica×Irisconfuse種間雜種的細胞遺傳學研究[J].云南植物研究,2003,25(4):497-502.

[11] 黃蘇珍,顧姻,賀善安.鳶尾屬植物的雜交育種及其同功酶分析[J].植物資源與環(huán)境,1996,5(4):38-41.

[12] 畢曉穎,婁琦,鄭洋.馬藺與溪蓀種間雜交親和性研究[J].園藝學報,2011,38(5):977-984.

[13] 畢曉穎,李卉，婁琦,等.野鳶尾和射干屬間雜交親和性及雜種鑒定[J].園藝學報,2012,39(5):931-938.

[14] 胡適宜.植物胚胎學試驗方法(一)花粉生活力的測定[J].植物學通報,1993,10(2):60-62.

[15] 李辛雷,陳發(fā)棣,趙宏波.菊屬植物遠緣雜交親和性研究[J].園藝學報,2008,35(2):257-262.

[16] 鄧衍明,葉曉青,佘建明,等.植物遠緣雜交育種研究進展[J].華北農(nóng)學報,2011,26(增刊):52-55.

[17] 劉春,穆鼎,明軍,等.百合種間雜交受精前障礙的研究[J].園藝學報,2006,33(3):653-656.

[18] 婁琦.鳶尾種間雜交親和性及胚胎研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學,2011.

Crossbreeding Barriers of Interspecific Hybridization betweenIrishalophilaPall andI.pseudocorusL./

Yang Zhanhui, Shi Yanyan, Gao Yike, Zhan Qixiang(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-94～97

IrisL.; Interspecific hybridization; Crossbreeding barriers; Embryo rescue

1) 國家林業(yè)局“948”引進項目( 2013-4-46)。

楊占輝，1987年8月生，北京林業(yè)大學園林學院，碩士研究生。

高亦珂，北京林業(yè)大學園林學院，教授。E-mail：gaoyk@bjfu.edu.cn。

2013年4月16日。

S682.21+9； S722.3+4

責任編輯：任 俐。

The experiment was conducted to study the crossbreeding barriers between twoIrisspecies,I.halophilaPall andI.pseudocorusL., and determine the pollen viability, pollen tube behaviors after common pollination, embryology observation and embryo rescue. Post-zygotic barrier is the main reason for the cross incompatibility betweenI.halophilaandI.pseudacorus, and it expresses embryo abortion in early zygophase. No capsules are obtained from reciprocal crosses, and there are pro-zygotic barriers in the two combinations. The stylar canal after 48 hours pollination inI.halophila×I.pseudacorusis blocked by a large number of embolism, while after two hours pollination inI.pseudacorus×I.halophilasome corpus callosum appeares on stigma. However, there is still a small amount of pollen tube at ovules of both combinations ultimately. The failures of embryo and endosperm inI.halophila×I.pseudacorusandI.pseudacorus×I.halophila, respectively, occur at 9-15 days and 15-21 days after pollination. Six days after pollination is the appropriate time for embryo rescue ofI.pseudocorus×I.halophila, and there are inflated ovules in medium of MS+2.0 mg·L-16-BA.