賀 丹,鄭云冰,何松林*,解夢(mèng)珺,蘇曉迪,王 政,劉藝平

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,河南 鄭州 450002

2.河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453000

牡丹（Paeonia suffruticosa）和芍藥（Paeonia lactiflora）均為芍藥科芍藥屬（Paeonia）植物，著名觀賞、藥用花卉，深受人們的喜愛，具有極高的園林觀賞價(jià)值和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。雜交育種作為提高植物觀賞價(jià)值、培育園藝新品種的主要途徑[2-4]，在牡丹、芍藥間的應(yīng)用已有百年歷史[5]。通過雜交育種，已經(jīng)選育出了一系列觀賞價(jià)值高、抗寒、抗病的新品種[6]，但是牡丹芍藥間的遠(yuǎn)緣雜交育種工作依然存在問題，二者雜交育種周期長(zhǎng)，培育新品主要表現(xiàn)為受精前障礙與雜種敗育等問題。在多組牡丹與芍藥間遠(yuǎn)緣雜交育種試驗(yàn)中，均發(fā)現(xiàn)了存在受精前障礙，嚴(yán)重影響雜交結(jié)實(shí)率，并發(fā)現(xiàn)不親和性主要是不親和的花粉導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)難度高。其關(guān)鍵原因是物種之間在長(zhǎng)期的進(jìn)化中形成了生殖隔離，常表現(xiàn)出雜交不親和性，柱頭組織中產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)沉積，從而阻礙了花粉管的生長(zhǎng)[7-9]。為克服花粉與柱頭之間的不親和性，一般在授粉后，通常采用遠(yuǎn)緣雜交育種與胚珠培養(yǎng)相結(jié)合的方法來獲得幼苗[10]。

胚珠培養(yǎng)技術(shù)對(duì)獲得優(yōu)良的雜種后代具有重要作用，獼猴桃種間遠(yuǎn)緣雜交利用胚珠培養(yǎng)獲得了雜交后代并初步探討了不同培養(yǎng)基類型對(duì)其發(fā)育的影響，獲得了以狗棗獼猴桃為親本的遠(yuǎn)緣雜交后代，豐富了獼猴桃遠(yuǎn)緣雜交的胚挽救體系，為培育出更多獼猴桃新種質(zhì)創(chuàng)造了條件[11]。桔梗的自花授粉結(jié)實(shí)率低，對(duì)經(jīng)花藥得到純合二倍體的未受精胚珠進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到桔梗單倍體植株，為桔梗的遺傳研究和育種實(shí)踐提供了豐富的自交系材料[12]。隨著對(duì)非洲菊未受精胚珠離體誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，非洲菊未受精胚珠離體誘導(dǎo)植株高頻再生體系逐漸完善，避免了供體材料選擇的盲目性，為高效誘導(dǎo)非洲菊單倍體植株，快速構(gòu)建DH 群體和選育優(yōu)質(zhì)新品種奠定基礎(chǔ)[13-16]。

本試驗(yàn)選取性狀優(yōu)良的牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜交系種子進(jìn)行胚珠培養(yǎng)，建立胚珠培養(yǎng)體系，旨在研究胚珠離體萌發(fā)中的影響因素。本實(shí)驗(yàn)室通過大量組織切片，發(fā)現(xiàn)只是在授粉后9～10 d 能觀察到少量正常球型胚，但之后胚體就開始異常降解，選擇人工授粉后第9 d～15 d 的胚珠，設(shè)置不同濃度NAA、IBA 處理的初代培養(yǎng)基，在常規(guī)培養(yǎng)條件下初代培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入不同濃度GA3、IBA 處理的繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。確定適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，摸索出培養(yǎng)的最適胚齡以及培養(yǎng)基類型，為胚珠培養(yǎng)技術(shù)輔助遠(yuǎn)緣雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交親本材料選自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三試驗(yàn)田，長(zhǎng)勢(shì)均等良好、無病蟲害的牡丹品種‘鳳丹白’（Paeonia ostii‘Feng dan bai’）、芍藥品種‘粉玉奴’（Paeonia lactiflora‘Fen yu nu’）。以正交‘粉玉奴’ב鳳丹白’、反交‘鳳丹白’ב粉玉奴’兩個(gè)雜交組合的胚珠作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

采用胚齡分別為人工授粉后9 d，10 d，11 d，12 d，13 d，14 d，15 d 的兩個(gè)雜交組合的胚珠作為外植體，將滅菌消毒后的試驗(yàn)材料在無菌條件下沿種莢腹背線剖開，取出整排胚珠，迅速接種于預(yù)先配置的啟動(dòng)培養(yǎng)基上（表1）。將其先放置于培養(yǎng)室中（溫度24±1 ℃）進(jìn)行黑暗培養(yǎng)2 周，隨后轉(zhuǎn)至常規(guī)培養(yǎng)條件（溫度24±1 ℃，光強(qiáng)2000 LX，光照時(shí)間12 h·d-1）下進(jìn)行初代培養(yǎng)，定期觀察培養(yǎng)物污染、褐化、胚珠膨大等萌發(fā)表現(xiàn)，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)指標(biāo)。

把經(jīng)過初代培養(yǎng)的試管胚珠轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上（表2），在常規(guī)培養(yǎng)條件（溫度24±1 ℃，光強(qiáng)2000 LX，光照時(shí)間12 h·d-1）下進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察胚的萌發(fā)發(fā)育情況。

表1 啟動(dòng)培養(yǎng)基及激素組合Table 1 Initial medium and hormone combination

表2 繼代培養(yǎng)基及激素組合Table 2 Subculture medium and hormone combination

2 結(jié)果與分析

2.1 胚齡對(duì)胚珠萌發(fā)的影響

2.1.1 胚齡對(duì)正交胚珠培養(yǎng)萌發(fā)的影響 如圖1、表3 所示，不同發(fā)育時(shí)期的胚珠在啟動(dòng)培養(yǎng)過程中的表現(xiàn)不同。胚齡9～15 d 的胚珠在初代培養(yǎng)時(shí)，前期（≤20 d）胚珠保持乳白色，少量胚珠增大。培養(yǎng)45 d 時(shí)，胚齡9 d 的胚珠大部分轉(zhuǎn)綠并膨大，褐化少，少數(shù)出現(xiàn)畸形生長(zhǎng)現(xiàn)象；胚齡10 d 的胚珠開始轉(zhuǎn)綠并膨大，胚珠死亡數(shù)少。培養(yǎng)65 d 時(shí)，齡期9 d～14 d 的胚珠部分開始死亡；胚齡15 d 的存活胚珠仍為白色。培養(yǎng)80 d 時(shí)，9～11 d 的胚珠顏色轉(zhuǎn)為深綠，并出現(xiàn)假死現(xiàn)象；齡期14 d，15 d 的胚珠大部分褐化死亡，個(gè)別生長(zhǎng)極緩慢，培養(yǎng)15 d 后死亡。[A]培養(yǎng)45 d 時(shí)，胚齡9 d 的胚珠大部分轉(zhuǎn)綠并膨大，褐化少，其中少數(shù)出現(xiàn)畸形萌發(fā)現(xiàn)象；[B]胚齡10 d 的胚珠開始轉(zhuǎn)綠并膨大，胚珠死亡數(shù)少；[C]胚齡11 d 的胚珠可能由于滅菌不徹底導(dǎo)致污染率較高，且大部分為白色；[D]胚齡13 d 的胚珠褐化程度較高，少部分轉(zhuǎn)綠，并在培養(yǎng)90 d 時(shí)全部褐化死亡；[E]胚齡14 d 的胚珠部分仍為乳白色，少數(shù)轉(zhuǎn)綠且萌發(fā)緩慢；[F]胚齡15 d 的胚珠多數(shù)褐化死亡，多數(shù)皆為乳白色且萌發(fā)緩慢。

圖1 正交胚珠培養(yǎng)Fig.1 Orthogonal ovule culture

表3 不同發(fā)育時(shí)期的正交胚珠在培養(yǎng)中的萌發(fā)表現(xiàn)Table 3 Germination of orthogonal ovule at different developmental stages in culture

圖2 不同胚齡對(duì)正交胚珠萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of different embryo ages on the germination of orthogonal ovule

在整個(gè)培養(yǎng)過程中，胚齡9 d 的胚珠膨大率、存活率最高，褐化率、污染率與畸形膨大率最低，其次為胚齡10 d 的胚珠。綜上認(rèn)為齡期9 d，10 d 的胚珠可以用來做前期培養(yǎng)（圖2）。

2.1.2 胚齡對(duì)反交胚珠培養(yǎng)萌發(fā)的影響 從圖3、表4 可以看到，胚齡9～15 d 的胚珠在培養(yǎng)前期（≤8 d）為乳白色，無明顯增大。培養(yǎng)20 d 時(shí)，胚珠開始膨大。40 d 時(shí)，胚齡9～10 d 的胚珠開始變綠，12～15 d 的胚珠已全部轉(zhuǎn)綠。培養(yǎng)60 d 時(shí)，胚齡9～11 d 的胚珠部分緩慢膨大；胚齡12～13 d 的胚珠大部分膨大迅速，試驗(yàn)中剖開一部分發(fā)現(xiàn)胚乳中央存在空腔，未觀察到種胚。培養(yǎng)90 d 時(shí)，胚齡9 d、11 d的胚珠大部分萎焉死亡，少數(shù)綠色胚珠生長(zhǎng)緩慢；胚齡10 d 的胚珠少數(shù)出現(xiàn)玻璃化、畸形生長(zhǎng)；胚齡12 d 的胚珠大量萎焉死亡，少數(shù)生長(zhǎng)緩慢；胚齡13 d 的胚珠死亡數(shù)少，玻璃化程度高；胚齡14～15 d 的胚珠極少數(shù)綠色胚珠生長(zhǎng)緩慢。

由表4 可知，胚齡為11 d，12 d，13 d 的胚珠存活率、胚珠膨大率、胚珠死亡率高，污染率、畸形膨大率低，萌發(fā)情況相對(duì)較好，可以用來做前期培養(yǎng)。

圖3 反交胚珠培養(yǎng)Fig.3 Reciprocal cross ovule culture

[A]胚齡9～15 d 的胚珠在培養(yǎng)前期（≤8 d）為乳白色，不增大；[B]40 d 時(shí)，胚齡9～10 d 的胚珠開始變綠；[C]胚齡12～15 d 的胚珠轉(zhuǎn)為淺綠色，開始膨大；[D]培養(yǎng)60 d 時(shí)，胚齡9 d 的胚珠部分膨大，少數(shù)萎焉死亡；[E]胚齡10～11 d 的胚珠少部分膨大較快；[F]胚齡12～13 d 的胚珠大部分膨大迅速；[G]胚齡14 d 的胚珠大部分萎焉死亡，少部分繼續(xù)膨大；[H]胚齡15 d 的胚珠一半萎焉死亡，試驗(yàn)中剖開一部分發(fā)現(xiàn)胚乳中央存在空腔，未觀察到種胚。

表4 不同發(fā)育時(shí)期的反交胚珠在培養(yǎng)中的萌發(fā)表現(xiàn)Table 4 Germination of reciprocal cross ovule at different developmental stages in culture

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)正、反交胚珠萌發(fā)的影響

2.2.1 不同初代培養(yǎng)基對(duì)正交胚珠萌發(fā)的影響 經(jīng)過45 d 的培養(yǎng)，從圖5 可以看出在9 種培養(yǎng)基中，在褐化程度上各組數(shù)據(jù)普遍偏高，在9 種培養(yǎng)基中，處理2 的存活率最高，其次為處理1，處理4；處理6 的畸形膨大率最低，其次為處理4，處理1；處理5 的污染率最低，其次為處理6，處理9；處理6 的胚珠膨大率最高，為90.32%，其次為處理4，處理5；在褐化程度上普遍偏高，其中處理4最低，其次為處理2，處理1。處理4 和處理6 培養(yǎng)基的存活率高、畸形膨大率低、污染率低、胚珠膨大率高，最適于對(duì)胚珠萌發(fā)啟動(dòng)生長(zhǎng)。

圖4 不同胚齡對(duì)反交胚珠萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of different embryo ages on the germination of reciprocal cross ovules

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)正交胚珠萌發(fā)的影響Fig.5 Effect of different culture medium on germination of orthogonal ovule

2.2.2 不同初代培養(yǎng)基對(duì)反交胚珠前期萌發(fā)的影響 經(jīng)過60 d 的培養(yǎng)，從圖6 中可見，排名在前三位的胚珠畸形膨大率由低到高依次為處理5，處理4，處理6；污染率由低到高分別為處理1，處理5，處理8；存活率由高到低分別為處理5，處理3，處理4；胚珠膨大率由高到低依次為處理4，處理6，處理5；胚珠死亡率由低到高依次為處理3，處理4，處理5。處理4、5 胚珠畸形膨大率低、污染率低、存活率高、胚珠膨大率高且胚珠死亡率低，作為胚珠初代萌發(fā)培養(yǎng)基較為合適。

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)反交胚珠前期萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of different culture medium on the early germination of reciprocal cross ovules

2.2.3 不同繼代培養(yǎng)基對(duì)正、反交胚珠繼代萌發(fā)的影響 正交培養(yǎng)結(jié)果表明（表5），發(fā)育早期（≤15d）的胚珠繼代培養(yǎng)不成功，雖然處理1 中胚珠的褐化程度較其他處理輕，存活時(shí)間也較長(zhǎng)，部分胚珠顏色轉(zhuǎn)綠，體積也略有增大，但在繼代后35 d 內(nèi)胚珠逐漸增長(zhǎng)緩慢且最終也逐漸變黑死亡。

反交胚珠繼代培養(yǎng)結(jié)果如圖7 所示，培養(yǎng)30 d 后，在4 種培養(yǎng)基中，雖然處理4 在反交胚珠繼代培養(yǎng)中胚珠膨大率與生存率相對(duì)于其他處理較高，但是在繼代后期胚珠逐漸停止萌發(fā)，且大量皺縮直至全部變白死亡。

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)正交胚珠繼代萌發(fā)的影響Table 5 Effect of different culture medium on transgenerational germination of orthogonal ovule

圖7 不同培養(yǎng)基對(duì)反交胚珠繼代萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of different culture medium on transgenerational germination of reciprocal cross ovules

3 討論

3.1 不同胚齡對(duì)正反交胚珠的影響

本試驗(yàn)通過對(duì)牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜交敗育前的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，選擇不同胚齡的胚珠，使用不同類型的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明，胚珠的胚齡明顯影響離體培養(yǎng)效果，雖然齡期9 d，10 d 的胚珠膨大率較高，存活時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，但在培養(yǎng)65 d 后相繼變黑死亡。年幼胚珠培養(yǎng)不成功的原因可能是胚珠內(nèi)部種胚還處于游離核或細(xì)胞化時(shí)期，或種胚已經(jīng)完成細(xì)胞化，處于胚原基發(fā)生階段，異養(yǎng)時(shí)期，不具備某種合成能力，還需要從胚乳中吸取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。幼胚敗育時(shí)間越早，幼胚越小，發(fā)育早期種胚未完成器官分化的胚珠所需的環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)成分也就越復(fù)雜[17]。齡期11 d、12 d、13 d的反交胚珠在初期培養(yǎng)過程中萌發(fā)迅速，培養(yǎng)60 d 時(shí)全部轉(zhuǎn)綠且膨大率相對(duì)較高，但其與正交情況相似，也在轉(zhuǎn)綠后40 d 內(nèi)逐漸停止萌發(fā)，最后由綠變白死亡。此結(jié)果與何桂梅對(duì)牡丹雜交胚珠、Batygina[18]在塊根芍藥及珊瑚芍藥中的研究基本相似。胚齡是影響胚挽救的一個(gè)重要因素，胚發(fā)育早期所需的物質(zhì)較為復(fù)雜[19]。試驗(yàn)中不同胚齡胚珠的發(fā)育狀況各不相同，表明胚齡的選擇直接關(guān)系到胚珠培養(yǎng)的成功，若想通過胚珠培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)牡丹、芍藥雜交成苗，加速育種進(jìn)程，選擇合適胚齡胚珠是遠(yuǎn)緣雜交中防止早期胚敗育并獲得遠(yuǎn)緣雜種后代的一個(gè)重要途徑。

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)正反交胚珠萌發(fā)的影響

胚珠培養(yǎng)是在無菌條件下對(duì)外植體胚進(jìn)行解剖后培養(yǎng),由于胚體積比較小,操作比較困難,很容易損傷胚體,從而影響胚離體培養(yǎng)萌發(fā)與成苗率[20]。本試驗(yàn)對(duì)反交子房進(jìn)行切半處理,胚珠較易剝離，可以獲得較為完整的外植體。

胚珠培養(yǎng)過程中受多種因素的制約，培養(yǎng)基是影響胚珠正常萌發(fā)的重要因素之一。本試驗(yàn)對(duì)正交胚珠初代培養(yǎng)45 d 后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基MS+NAA0.5 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1或IBA0.5 mg·L-1胚珠萌發(fā)的各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)較好；反交胚珠初代培養(yǎng)60 d 后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基MS+NAA0.5 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1或IBA1.0 mg·L-1胚珠萌發(fā)的各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)較高。高污染率與褐化率是牡丹、芍藥組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象[21]，在正交培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，胚珠褐化程度普遍較高，此結(jié)果與何桂梅等[22]的研究結(jié)果基本一致。其原因之一可能是滅菌時(shí)間過長(zhǎng)產(chǎn)生了毒害作用，其二可能是胚珠自身含有酚類物質(zhì)，在培養(yǎng)過程中易發(fā)生氧化作用而導(dǎo)致胚珠褐化。因此，試驗(yàn)后認(rèn)為，胚珠離體培養(yǎng)時(shí)應(yīng)盡量采用直接消毒方式，采用更強(qiáng)的消毒劑。為降低褐化程度，使胚珠在隨后的繼代培養(yǎng)中正常萌發(fā)，在培養(yǎng)基中還應(yīng)加入一些其它物質(zhì)來防止胚珠褐化。

在繼代培養(yǎng)中，無論是正交還是反交胚珠，都在培養(yǎng)80 d 后時(shí)開始停止萌發(fā)并逐漸死亡。其原因可能是發(fā)育中后期的胚珠未完成器官分化或正處于器官分化狀態(tài)，萌發(fā)所需的離體培養(yǎng)基條件比較復(fù)雜，如培養(yǎng)基中的激素類型、濃度配比等還需進(jìn)一步的探索。綜合雜交與胚珠培養(yǎng)的結(jié)果認(rèn)為，胚珠繼代培養(yǎng)對(duì)胚珠后期萌發(fā)至關(guān)重要，雖然目前胚珠培育成苗還需優(yōu)選培養(yǎng)基及優(yōu)化操作程序，但該技術(shù)對(duì)育種周期較長(zhǎng)的牡丹芍藥遠(yuǎn)緣育種有較大的應(yīng)用潛力，值得深入研究。但在雜交育種工作中仍有諸多問題尚未解決，如幼胚繼代培養(yǎng)、雜交種褐化嚴(yán)重問題都大大影響了育種工作的效率。因此，在以后的工作中，應(yīng)著重從繼代培養(yǎng)基的篩選、激素組合、減輕褐化等方面進(jìn)行雜種胚挽救的研究，為今后牡丹的育種工作開辟新的方向。