寇 敘，劉永華，唐雨順

(遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121001)

產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)廣泛存在于土壤、人和動物腸道，可引起人和動物多種疾病。兔產氣莢膜梭菌病(Clostridium welchii’disease)是由A型產氣莢膜梭菌引起兔的一種以劇烈腹瀉為特征的急性、致死性傳染?。?］。除哺乳仔兔外，不同年齡、品種、性別的家兔對本菌均易感，1～3月齡仔兔發(fā)病率最高［2］。2012年4月初，遼寧省錦州市黑山縣某兔場的幾只仔兔突然出現發(fā)病、死亡現象，隨后疫情逐漸擴大，1周內共有100只仔兔發(fā)病，發(fā)病率為50%(100/200);死亡65只，致死率為65%(65/100)。為此，對其進行了流行病學資料調查、臨床癥狀和剖檢病變觀察、病原的分離與鑒定實驗，同時對分離菌株進行藥物篩選，選取敏感藥物交替治療，取得了一定的治療效果，再無新病例發(fā)生，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 獲取遼寧省錦州市黑山縣某兔場病死兔10只，常規(guī)無菌操作，采集其胃、腸內容物、心血及心、肝、脾、肺、腎、肌肉、糞便等樣本共50份。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、斜面營養(yǎng)培養(yǎng)基、血液瓊脂平板、血液斜培養(yǎng)基均由實驗室自制。

1.1.3 試劑 生化培養(yǎng)及藥敏實驗試劑購自沈陽聯星試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 染色鏡檢 將無菌采取的心、肝、脾、肺、腎、肌肉等組織樣本涂片，分別進行革蘭和美蘭染色鏡檢。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 取胃、腸內容物、心血、糞便等樣本勻漿后用少量滅菌生理鹽水制成懸液分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床常規(guī)及厭氧培養(yǎng)24 h。然后將肉湯培養(yǎng)液和組織樣本接種于普通瓊脂平板、血瓊脂平板上，進行37℃常規(guī)及厭氧培養(yǎng)24 h。結果僅在厭氧培養(yǎng)條件下有細菌生長，挑取血瓊脂平板上單個菌落轉種于厭氧增菌培養(yǎng)基中，37℃增菌培養(yǎng)24 h。

1.2.3 生化試驗 分別勾取分離菌純培養(yǎng)物接種于糖類、肌醇、水楊苷［3］等生化試驗培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48 h后判定結果。

1.2.4 致病性試驗 將純化好的分離菌接種到血液斜面培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h后制成菌懸液，并與麥氏濁管進行比濁，均選取濃度為30×108個活菌/mL分別腹腔注射2只昆明鼠，0.5 mL/只。同時應用0.22 μm細菌濾器分別對上述分離菌懸液過濾后各取濾液腹腔注射2只昆明鼠，0.5 mL/只，作為對照，觀察結果。

1.2.5 藥敏試驗 分別用滅菌棉拭子蘸取致病性試驗中選取濃度為30×108個活菌/mL的菌懸液［4］均勻涂布MH平板，經室溫干燥3～5 min后，貼上藥敏紙片，每塊平板貼3片，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結果。判定標準參照美國實驗室標準委員會(NCCLS)藥敏紙片擴散法法規(guī)。

2 結果與分析

2.1 染色鏡檢

心、肝、肺、脾、腎、肌肉等樣本涂片后革蘭染色陽性，在鏡下可見兩端鈍圓的粗大桿菌，單個存在，短鏈較少，無鞭毛，不能運動具有明顯的莢膜，有的菌體中央或近端有芽胞，小于菌體橫徑(圖1)。

圖1 產氣莢膜梭菌吉姆薩染色光鏡照片Fig.1 Light microscope giemsa stained Clostridium perfringens

2.2 細菌分類培養(yǎng)

該菌僅在厭氧條件下生長為專性厭氧菌，肉湯培養(yǎng)液變渾濁并產生大量氣體。在血瓊脂平板上形成莢膜，無芽胞。菌落圓形、光滑、隆起、淡黃色、直徑2～4 mm，有的呈圓盤形，邊緣成鋸齒狀。菌落周圍有棕色溶血區(qū)，呈輻射狀條紋。

2.3 生化試驗

通過與標準菌株進行生化特性對比，分離菌的生化試驗結果與標準菌株相符(見表1)。

表1 菌落生化試驗結果Table1 Bacterial colony biochemical test result

2.4 致病性試驗

實驗組小鼠在接種菌液后1 h，精神沉郁，48 h內2只小鼠先后死亡，對照組存活。剖檢死亡小鼠可見腹膜、腸系膜充血。小腸段的黏膜充血、點狀出血，部分糜爛;大腸段黏膜潰瘍，部分黏膜脫落。采集實質臟器分離，分別分離到了與上述一致的革蘭陽性大桿菌。對照組小鼠飼喂1周后仍健活。

2.5 藥敏試驗

比較抑菌圈直徑結果表明，該菌株對氟苯尼考、頭孢哌酮、哌拉西林、氨芐西林、萘啶酸、諾氟沙星、克林霉素等敏感，對紅霉素、甲硝唑、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、呋喃妥因中度敏感，對氟哌酸、卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明、阿米卡星、呋喃唑酮等不敏感(見表2)。

表2 分離菌對18種抗生素的敏感性試驗Table2 18 kind of antibiotic sensitivity test to bacteria

3 討論

產氣莢膜梭菌是一種梭狀芽胞桿菌，屬于條件性致病菌，是動物腸道中的常在菌群之一，廣泛分布于自然界和畜舍環(huán)境中，可見于舍內空氣、土壤、污水、飼料、食物和糞便。該菌可引起人食物中毒和家畜氣腫疽，該菌也是引起畜禽猝死癥、壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽的主要致病菌。兔是易感動物之一。兔產氣莢膜梭菌病一年四季均可發(fā)生，以冬、春兩季最為常見，即使是在飼養(yǎng)管理條件較好的兔場，也有該病的發(fā)生［5］。1979年我國首次在江蘇省昆山種兔場發(fā)現兔的梭菌性下痢，至今已在江蘇、山東、福建等20多個省市、自治區(qū)發(fā)現了兔產氣莢膜梭菌?。?］。根據該兔場發(fā)病兔的臨床癥狀和剖檢變化可以初步診斷為細菌感染，經過多組織和臟器樣本的涂片觀察可見到典型的兩端鈍圓的粗大桿菌，單個存在，經分離培養(yǎng)和生化實驗，結果均符合產氣莢膜梭菌的特征，確定為產氣莢膜梭菌，診斷該兔場發(fā)生了產氣莢膜梭菌感染。兔產氣莢膜梭菌病死亡癥狀與一些化學物質中毒有很多相似之處，容易被診斷為化學物質中毒。因此，必須做實驗室診斷，通過細菌學、毒物學檢查進一步確診［7］。由于存在細菌耐藥性問題，經藥敏實驗篩選合適的藥物治療，是十分必要的。此次分離菌株的敏感藥物有氟苯尼考、頭孢哌酮、哌拉西林、氨芐西林等，應用氟苯尼考治療1周，取得了良好的治療效果，再無新病例發(fā)生。

［1］付強，王艷，李峰.一株兔源魏氏梭菌的分離鑒定［J］.中國養(yǎng)兔，2008，(5):30-33.

［2］孫艷平，向鐘平，包秀芬，等.肉兔病毒性出血癥病毒與A型產氣莢膜梭菌混合感染的診斷［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(10):215-216.

［3］王超，陳啟和，倪輝，等.1株枯草芽胞桿菌的鑒定及其彈性蛋白酶結構研究［J］.微生物學雜志，2012，32(3):13-19.

［4］陳銳，李玥，韓麗萍，等.陜西定邊鹽湖嗜鹽菌A393的分離及其種屬鑒定［J］.微生物學雜志，2012，32(5):28-31.

［5］胡新崗，黃銀云，金彩蓮，等.犬源魏氏梭菌分離鑒定及藥敏實驗［J］.養(yǎng)殖與飼料，2007，(1):12-14.

［6］吳憶春.兔產氣莢膜梭菌SD12株的分離與血清型鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(3):192-194.

［7］黃建華，陳松明.一例德國牧羊犬魏氏梭菌毒素中毒引起猝死的診斷報告［J］.畜牧與獸醫(yī)，2013，45(2):109-110.