齊育平，孫 蕾，劉琴英，蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是指一類能夠通過(guò)同型發(fā)酵或異型發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌［1］。大多數(shù)乳酸菌是有著重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的食品級(jí)微生物［2］。谷氨酸脫羧酶［3］(Glutamate decarboxylase，EC 4.1.1.15，簡(jiǎn)稱GAD)在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，催化谷氨酸的α-脫羧反應(yīng)，生成γ-氨基丁酸(GABA)，是GABA唯一的合成酶［4］，對(duì)維持整個(gè)GABA能系統(tǒng)穩(wěn)定地運(yùn)轉(zhuǎn)起著至關(guān)重要的作用。乳酸菌是一種優(yōu)良、高產(chǎn)、安全的菌種，利用乳酸菌生產(chǎn)GABA已經(jīng)成為一種較為理想的生物合成方法。目前已有多種乳酸菌的谷氨酸脫羧酶基因被克?。?-8］。生物信息學(xué)(bioinformatics)是一門利用應(yīng)用數(shù)學(xué)、信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的方法研究生物學(xué)問(wèn)題的學(xué)科。生物信息學(xué)的研究工具是計(jì)算機(jī)，研究方法包括對(duì)生物學(xué)數(shù)據(jù)的搜索(收集和篩選)、處理(編輯、整理、管理和顯示)及利用(計(jì)算、模擬)。目前主要的研究方向有序列比對(duì)、基因識(shí)別、基因重組、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)反應(yīng)的預(yù)測(cè)以及建立進(jìn)化模型。本文以1株高產(chǎn)GABA的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)Lb-2菌株［9］為研究對(duì)象，克隆了其GAD基因，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析了其氨基酸組成、理化性質(zhì)、信號(hào)肽及其高級(jí)結(jié)構(gòu)等，以期指導(dǎo)分析該菌株的高產(chǎn)GABA特性、后續(xù)目的基因的表達(dá)純化以及研究該酶的生物學(xué)特性等。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短乳桿菌(Lactobacillus brevis)Lb-2菌株為本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的1株高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良的MRS培養(yǎng)基(g):蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸鈉2，檸檬酸二胺2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.50。

1.1.3 主要數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 NCBI blast:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/、ExPASy:http://www.expasy.org/、SignalP:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/、GOR Ⅰ:http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor.html、PSORT WWW Server:http://psort.hgc.jp/、SWISS-MODEL:http://swissmodel.expasy.org/;LaserGene、MEGA4、DNAMAN。

1.2 方法

1.2.1 GAD基因克隆 以本實(shí)驗(yàn)室分離得到的短乳桿菌Lb-2菌株cDNA為模板，參照已發(fā)表的短乳桿菌GAD核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物Forward:5'-ATG TTA CAC AGG CAC GGT TCT AAG CAG AAG-3';下游引物Reverse:5'-TCA ACA TGT TCC TCT ATA GTT TCT C-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工公司合成。

1.2.2 GAD基因氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域 利用綜合性序列工具軟件LaserGene中的ORF Finder確定其完整的編碼序列(complete coding sequence，CDS)，然后保存為Translation Sequence格式，輸出其氨基酸序列。利用NCBI的Conserved Domains檢測(cè)該序列的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 ProtParam預(yù)測(cè)GAD的理化性質(zhì) 用Ex-PASy［9］的ProtParam［10］工具對(duì)GAD氨基酸序列進(jìn)行分析，如分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、摩爾消光系數(shù)、半衰期、穩(wěn)定性等。

1.2.4 GAD 的基本信息分析 Motifscan［11］預(yù)測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)中糖基化、脂?；⒘姿峄?、硫酸化、GPI錨著位點(diǎn)等修飾位點(diǎn)和模序;用SignalP 4.1［12］在線進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè);用PSORT WWW Server中的PSORT Prediction工具進(jìn)行細(xì)胞定位;用ExPASy的ProtScale進(jìn)行在線蛋白質(zhì)疏水性分析。

1.2.5 GAD 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 多肽鏈的螺旋和折疊使氨基酸形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，從而使蛋白具有特定理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，利用GORⅠ完成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.6 GAD 三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模 SWISS-MODEL［13-14］是一種使用同源建模方法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的工具，利用Automated Mode將GAD與蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，預(yù)測(cè)GAD的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以比較不同物種間的進(jìn)化距離，進(jìn)而判斷它們的親緣關(guān)系。檢索GenBank中已公布的GAD氨基酸序列，使用MEGA4［15］軟件進(jìn)行對(duì)比分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)［15］。

1.2.8 多序列比對(duì) 利用DNAMAN軟件將獲得的GAD氨基酸序列與NCBI里已公布的4種短乳桿菌GAD氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)，分析所克隆到的GAD與其他短乳桿菌菌株GAD的異同。另4種分別為短乳桿菌877G菌株(Lb-877G，登錄號(hào):AFU61547.1)、短乳桿菌 BH2菌株(Lb-BH2，登錄號(hào):ABU55419.1)，短乳桿菌CGMCC 1306菌株(Lb-CGMCC 1306，登錄號(hào):ADG02973.1)和短乳桿菌ATCC 367菌株(Lb-ATCC 367，登錄號(hào):YP_795941.1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAD 基因的克隆

本實(shí)驗(yàn)以短乳桿菌(圖1)cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分析獲得一長(zhǎng)度為1 407 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)。

圖1 短乳桿菌Lb-2顯微形態(tài)Fig.1 The morphology of Lb-2

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoresis of PCR products

2.2 GAD 基因的氨基酸序列

將上述片段回收、測(cè)序，最終得到一條全長(zhǎng)為1 407 bp的序列(圖3)，經(jīng)軟件分析，該序列為一個(gè)完整的閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼468個(gè)氨基酸。將該序列進(jìn)行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)其與短乳桿菌877G菌株的GAD基因(登錄號(hào):JX545343.1)相似性為99%，與短乳桿菌BH2菌株的GAD基因(登錄號(hào):EU084998.1)相似性為98%，推測(cè)該序列為短乳桿菌GAD基因序列。將此氨基酸序列提交到Conserved Domains檢測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示(圖4)，該序列的保守結(jié)構(gòu)域類似多巴脫羧酶家族，該家族主要包括酪氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶和谷氨酸脫羧酶。

2.3 短乳桿菌GAD氨基酸序列的理化性質(zhì)

短乳桿菌GAD共有468個(gè)氨基酸(表1)，65個(gè)帶負(fù)電氨基酸殘基，46個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，亮氨酸(Leu)所占比重最高，為9.2%;理論分子量和等電點(diǎn)(PI)分別為53 517.8 u和5.42，分子式為C2412H3675N637O703S21;含有6個(gè)半胱氨酸，假設(shè)形成3對(duì)二硫鍵，則該蛋白在水溶液中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為87 125 M－1cm－1;蛋白濃度為l g/L時(shí)，半胱氨酸未形成二硫鍵吸光系數(shù)(Abs)為1.621。當(dāng)成熟肽氨基端的第一個(gè)氨基酸為甲硫氨酸(Met)時(shí)，GAD在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸埃希菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為27.11，低于閾值40，表明在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。脂溶指數(shù)為85.04，疏水指數(shù)為－0.297，初步判斷該蛋白是親水性蛋白。

2.4 短乳桿菌GAD的信息分析結(jié)果

GAD翻譯后的修飾位點(diǎn)分析結(jié)果顯示:GAD含有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn);3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn);5個(gè)潛在的N-肉豆蔻酰位點(diǎn);4個(gè)潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn);2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn);1個(gè)組氨酸脫羧酶活化位點(diǎn)，位于38～428位氨基酸;1個(gè)L-酪氨酸脫羧酶活化位點(diǎn)，位于45～445位氨基酸。

PSORT Prediction預(yù)測(cè)該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)。TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)其沒(méi)有跨膜區(qū)域。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白不含信號(hào)肽，可以推斷GAD在細(xì)胞質(zhì)中合成后，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn);TargetP結(jié)果未發(fā)現(xiàn)線粒體、過(guò)氧化物酶體、溶酶體和細(xì)胞核等亞細(xì)胞定位序列。

表1 短乳桿菌GAD的氨基酸組成Table1 The amino acid composition of GAD of Lb-2

圖3 短乳桿菌Lb-2的GAD基因及氨基酸序列Fig.3 The gene and amino acid sequence of GAD of Lb-2

圖4 短乳桿菌Lb-2的GAD的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 The conserved domains of GAD of Lb-2

ExPASy的ProtScale在線預(yù)測(cè)，疏水性氨基酸為正值，親水性氨基酸則為負(fù)值，氨基酸的絕對(duì)值越高則表明親疏水性越強(qiáng)。圖5顯示該GAD疏水性最小值約為－2.589，最大值約為2.544，整個(gè)多肽鏈中分值較低的氨基酸占多數(shù)，即親水性氨基酸比例高于疏水性氨基酸，因此推斷該蛋白為親水性蛋白，與ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 短乳桿菌Lb-2的GAD氨基酸序列親水性分析Fig.5 The hydrophilicity analysis of the amino acid sequence of GAD from Lb-2

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法有SOPM、SOPMA、HNN、PHD和GOR等，其中GOR方法將蛋白質(zhì)序列當(dāng)作一連串的信息值來(lái)處理，不僅考慮了被預(yù)測(cè)位置本身氨基酸種類的影響，而且考慮了相鄰氨基種類對(duì)該位置構(gòu)象的影響，預(yù)測(cè)效果較好。本文利用GORⅠ預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示(圖6)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋比例為51.71%，延伸鏈比例為31.20%，β-轉(zhuǎn)角占8.12%，無(wú)規(guī)卷曲占8.97%。

圖6 GORⅠ預(yù)測(cè)的短乳桿菌GAD二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 The predicted secondary structure of GAD by GORⅠ

2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

三級(jí)結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)再折疊成一個(gè)球形的、包裹緊密的立體空間結(jié)構(gòu)，可使一級(jí)結(jié)構(gòu)中2個(gè)離得較遠(yuǎn)的氨基酸殘基通過(guò)折疊使它們的側(cè)鏈相互靠近，并且通過(guò)疏水作用等構(gòu)成活性位點(diǎn)。采用SwissModel Automatic Modelling Mode預(yù)測(cè)短乳桿菌Lb-2的GAD三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，系統(tǒng)自動(dòng)選取了擬南芥(Arabidopsis thaliana)GAD1基因作為模板，兩者序列相似度為40.23%，Evalue值為 0.00e-1，QMEAN Z-Score為－2.54，四級(jí)結(jié)構(gòu)信息顯示該模型為單鏈模型，沒(méi)有配體。模型(圖7)顯示該GAD蛋白含有大量的α-螺旋和β-折疊，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

MEGA是一款主要集中于進(jìn)化分析進(jìn)而獲得綜合序列信息的軟件，可以編輯序列數(shù)據(jù)、序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、推測(cè)物種間的進(jìn)化距離等。在構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)時(shí)可提供4種方法:最大簡(jiǎn)約法、鄰接法、最小進(jìn)化法、算術(shù)平均的非加權(quán)對(duì)群法。本文采用MEGA對(duì)乳桿菌目中12種菌的GAD氨基酸序列基于鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)果如圖8所示，短乳桿菌GAD與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)親緣關(guān)系最近。

圖7 短乳桿菌Lb-2的GAD的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 The predicted tertiary structure of GAD from Lb-2

2.8 多重序列比對(duì)

5種短乳桿菌GAD氨基酸序列多重序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖9。從圖9中可以看出，5種短乳桿菌GAD氨基酸序列的長(zhǎng)度一致，都是467個(gè);短乳桿菌種間的GAD氨基酸序列差異很小，只有個(gè)別氨基酸的不同;本文得到的短乳桿菌Lb-2的GAD氨基酸序列在416位上為丙氨酸(A)，與其他序列有差異，但與短乳桿菌BH2菌株相同。

圖8 12種乳桿菌GAD的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 The phylogenetic trees of 12 GADs

3 討論

生物信息學(xué)研究的材料是生物學(xué)的數(shù)據(jù)，通過(guò)情報(bào)學(xué)的方法，綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、情報(bào)信息等工具，對(duì)生物信息加工后得到相關(guān)信息。生物信息學(xué)是新興的學(xué)科，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，在生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、能源等研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用［16］。

本研究克隆了短乳桿菌GAD基因序列，其全長(zhǎng)為1 407 bp，編碼468個(gè)氨基酸，有酪氨酸脫羧酶結(jié)構(gòu)域，理論分子量和等電點(diǎn)(PI)分別為53 517.8 u和5.42，位于細(xì)胞質(zhì)，為親水性蛋白，不含信號(hào)肽。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示α-螺旋比例為51.71%，延伸鏈比例為31.20%，β-轉(zhuǎn)角占8.12%，無(wú)規(guī)卷曲占8.97%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)該短乳桿菌GAD基因與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的GAD基因親緣關(guān)系最近。

應(yīng)用軟件預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有一定的局限性，雖然不可能做到完全正確，但總體上近似。此外，由于在蛋白質(zhì)性質(zhì)分析過(guò)程中采用的方法不同，也會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果有差異。因此，本研究基本采用目前生物領(lǐng)域較為認(rèn)可的信息學(xué)分析方法，通過(guò)這些生物信息學(xué)的分析方法所得到信息有一定的參考價(jià)值，有助于更加深入地認(rèn)識(shí)乳桿菌谷氨酸脫羧酶，為研究谷氨酸脫羧酶的表達(dá)、分離、純化提供借鑒。

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