張昭寰，郭丹鳳，王敬敬，林 婷，潘迎捷，趙 勇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

抗菌類藥物在全球范圍內(nèi)廣泛使用，有效地降低了傳染性疾病的發(fā)病率和致死率［1］。但是在抗菌類藥物治療病原菌感染的同時(shí)，由于細(xì)菌的選擇性壓力，必然導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生［2-3］，耐藥性細(xì)菌以及多重耐藥性細(xì)菌的不斷增加，給人類疾病的治療帶來了極大的困難?，F(xiàn)階段，細(xì)菌耐藥問題已經(jīng)引起世界范圍的關(guān)注，被WHO認(rèn)定為21世紀(jì)最大的安全衛(wèi)生問題之一［4-6］，各國及國際組織都積極地采取相應(yīng)的管理措施，來抑制和降低細(xì)菌耐藥性的增加和蔓延［7-10］。因此，如何對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行快速精準(zhǔn)的測(cè)定，成為當(dāng)今微生物科研的難點(diǎn)及熱點(diǎn)問題。常用的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法主要有Kirby-Bauer法、稀釋法、E-test法以及全自動(dòng)微生物分析儀測(cè)試方法。其中由Bauer和Kirby所建立的紙片瓊脂擴(kuò)散法，即KB紙片擴(kuò)散法，廣泛應(yīng)用于各國微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)菌耐藥性的測(cè)定［11-12］。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)規(guī)定［12］，K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行測(cè)定的傳統(tǒng)方法為:將菌液劃線進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落于生理鹽水中，稀釋到濃度為0.5 McFarland濁度(相當(dāng)于所接種的菌量為1.5×108cfu/mL)。CLSI推薦使用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液后在整個(gè)Mueller Hinton培養(yǎng)基表面進(jìn)行涂布，待培養(yǎng)基表面的菌液完全晾干后，貼上抗生素紙片，置于合適溫度下過夜培養(yǎng)，然后測(cè)量抑菌圈的直徑。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定為耐藥(resistant)、中介(intermediate)以及敏感(sensitive)。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種常見的食源性致病菌，感染該菌易引起急性胃腸炎和原發(fā)性敗血癥等疾?。?3-14］。根據(jù)我國食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)，以及其他各方面資料顯示，在微生物引起的食源性疾病爆發(fā)事件中，副溶血性弧菌污染為首要因素［14-15］。本文針對(duì)K-B紙片擴(kuò)散法以及重要的食源性致病菌副溶血性弧菌，運(yùn)用6種常見的抗菌類藥物，對(duì)K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行系統(tǒng)的改良和優(yōu)化，并利用8株野生副溶血性弧菌(本實(shí)驗(yàn)室分離于水產(chǎn)食品)對(duì)改良后的K-B法準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，旨在提出一種更高效、更便捷、更經(jīng)濟(jì)的副溶血性弧菌耐藥性測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Vibrio parahaemolyticusATCC33847;藥敏性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)置控菌株Escherichia coliATCC25922;實(shí)驗(yàn)室從上海市水產(chǎn)品中分離的8株野生副溶血性弧菌:VPWTD08、VPWTD12、VPWTD14、VPWTD15、VPWTD16、VPWTD17、VPWTD23、VPWTD25。

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani營養(yǎng)肉湯(LB，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)、Luria-Bertani營養(yǎng)瓊脂(LB，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS瓊脂，上海市疾病預(yù)防控制中心)、Mueller Hinton肉湯(MH，上海漢尼生物技術(shù)有限公司)、純化瓊脂(Agar D，上海漢尼生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 抗生素 阿莫西林-克拉維酸(Amoxicillin-clavulanic acid)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、阿米卡星(Amikacin)、四環(huán)素(Tetracycline)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、氯霉素(Chloramphenicol)，均購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器 Bio-Tek酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)、Eppendorf離心機(jī)(5810R，美國Eppendorf公司)、Milli-Q制水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 將副溶血性弧菌劃線接種于TCBS平板，挑取單菌落于5 mL TSB的試管中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化2次，作為種子液，備用。

1.2.2 利用標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建OD-菌數(shù)對(duì)應(yīng)公式取培養(yǎng)12 h的副溶血性弧菌(ATCC33847)種子液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在600 nm下的吸光值，對(duì)菌液進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)每個(gè)梯度下菌液的吸光值，同時(shí)將不同吸光值的菌液涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以副溶血性弧菌的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，菌懸液的吸光值OD600為橫坐標(biāo)做圖，得到OD-菌數(shù)對(duì)應(yīng)公式:

根據(jù)公式以及CLSI標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的1.5×108cfu/mL接種量確定OD值為0.352，將8株野生副溶血性弧菌的濁度稀釋至0.352左右，涂布于TCBS平板，37℃培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，觀察結(jié)果是否符合規(guī)定菌量。

1.2.3 培養(yǎng)皿的選擇 選定菌液濃度控制方法后，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33847)選擇實(shí)驗(yàn)室通常使用的玻璃培養(yǎng)皿以及一次性塑料培養(yǎng)皿(9 cm×9 cm)，進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)。用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去除多余菌液，在玻璃培養(yǎng)皿以及一次性塑料培養(yǎng)皿的MH瓊脂表面涂抹均勻，待瓊脂上的菌液晾干后，貼上6種抗生素紙片，每組4個(gè)平行試驗(yàn)，置于37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)涂布方法的優(yōu)化 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比涂抹菌液 100、200、300 μL的培養(yǎng)皿，確定了300 μL的定量接種方法，這與余修中［16］在其研究中提出定量接種0.35 mL菌液量基本一致。對(duì)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)涂布方法進(jìn)行改良，分為組1、組2、組3，組1，傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法:棉拭子蘸取菌液進(jìn)行涂布;組2，向MH瓊脂中加入300 μL菌液，用涂布棒進(jìn)行涂布;組3，向MH瓊脂中加入300 μL菌液，用棉拭子進(jìn)行涂布。待菌液晾干，貼上6種抗生素紙片，每組4個(gè)平行試驗(yàn)，置于37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 傳統(tǒng)試驗(yàn)與改良試驗(yàn)的對(duì)比 用傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法及改良后的藥敏試驗(yàn)法對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的8株野生副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，并繪制總流程圖，評(píng)價(jià)2種方法的優(yōu)劣。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS statistics 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液濃度確定方法的改良

OD600為0.352左右時(shí)，8株野生菌株的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明調(diào)OD方法所得接種量與CLSI標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的菌液濃度(1.5×108cfu/mL)相差不大，且相較于傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)中麥?zhǔn)媳葷岱?0.5 McFarland)，節(jié)省了16～18 h的單菌落培養(yǎng)時(shí)間。

表1 8株野生菌株OD600對(duì)應(yīng)的實(shí)際菌量Table1 Bacteria concentrations correspond to the OD600of eight wild types

2.2 培養(yǎng)皿的選擇

經(jīng)過SPSS分析，由表2可知，分別對(duì)比玻璃平板和塑料平板，阿莫西林-克拉維酸(AMC)和阿米卡星(AK)2組試驗(yàn)結(jié)果不存在顯著性差異(P＞0.05)，而其余4種抗生素均存在顯著性差異(P＜0.05)，圖1為玻璃平皿和一次性平皿測(cè)量抑菌圈的對(duì)比圖。

圖1 玻璃平皿(a)和一次性平皿(b)抑菌圈對(duì)比Fig.1 Comparison of inhibition zones of vitreous plate(a)and plastic plate(b)

表2 玻璃平皿與一次性平皿對(duì)于6種抗生素抑菌圈結(jié)果的對(duì)比(n=4)Table2 Comparison of inhibition zones of vitreous plate and plastic plate(n=4)

由上述分析可知，標(biāo)準(zhǔn)一次性平皿(9 cm×9 cm)與玻璃平皿測(cè)量抑菌圈的結(jié)果存在差異，這可能與玻璃平皿的大小、厚薄不一致有關(guān)，所以在藥敏試驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)一次性平皿比玻璃平皿有更好的準(zhǔn)確性。

2.3 藥敏試驗(yàn)涂布方法的優(yōu)化

比較3種涂布方法對(duì)于每種抗生素的變異系數(shù)(表3)，以及3種方法變異系數(shù)均值，可得組3的變異系數(shù)最小，說明組3重復(fù)性更好。而組2變異系數(shù)最高，可能是由于涂布棒的棒頭較大，造成涂布菌液浪費(fèi)，導(dǎo)致重復(fù)性不好。

對(duì)比組1和組3，棉拭子直接涂布和定量300 μL涂布，效果相差并不大，但由于棉拭子大小不一、蓬松程度差異較大，造成蘸取的菌量不同，不能保證每次的重復(fù)性均較好，所以在藥敏試驗(yàn)中，對(duì)菌液進(jìn)行定量控制，以保證藥敏試驗(yàn)較好的重復(fù)性。圖2為3種涂布方法測(cè)量抑菌圈的對(duì)比圖。

圖2 3種涂布方法測(cè)量抑菌圈對(duì)比Fig.2 Comparison of inhibition zones of three spreading methods

2.4 傳統(tǒng)試驗(yàn)與改良試驗(yàn)的對(duì)比

用傳統(tǒng)試驗(yàn)與改良后試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的8株野生副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，改良前后的測(cè)定結(jié)果基本一致，只有7組結(jié)果存在差異，其余41組結(jié)果相同，證明改良后的藥敏試驗(yàn)具有較好的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的流程圖與改良的藥敏試驗(yàn)的流程如圖3所示。

表3 3種涂布方法對(duì)于6種抗生素抑菌圈結(jié)果的變異系數(shù)(CV)的對(duì)比(n=4)Table3 Coefficient of variation(CV)of inhibition zones of three spreading methods(n=4)

表4 傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)與改良藥敏試驗(yàn)對(duì)8株副溶血性弧菌耐藥性判別結(jié)果的對(duì)比Table4 Comparison of traditional antimicrobial sensitivity test and improved antimicrobial sensitivity test

對(duì)比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法，改良后的藥敏試驗(yàn)方法具有以下優(yōu)點(diǎn):第一，在時(shí)間上節(jié)約了16～18 h培養(yǎng)獲得單菌落的時(shí)間;第二，選用標(biāo)準(zhǔn)大小的平板可進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度;第三，定量300 μL棉拭子涂布方法，既具有較高的重復(fù)性，又能節(jié)省涂布棒因反復(fù)灼燒而需要的時(shí)間;第四，在經(jīng)濟(jì)成本上，改良的藥敏試驗(yàn)因省去了劃線培養(yǎng)環(huán)節(jié)，從而節(jié)約了培養(yǎng)基使用量。

3 討論

抗生素的大量使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題，已成為世界性難題，特別是由于多重耐藥菌株感染而導(dǎo)致死亡的報(bào)道逐年增加［4-9］。細(xì)菌耐藥性的形成有多種原因，包括細(xì)菌自身的原因［17］，濫用抗生素的原因以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展的不良惡果，其中最主要原因在于抗生素藥物的過度使用［1-2］。多重耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，極大地危害了人類的健康，甚至引起社會(huì)的恐慌。所以，有效的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法的提出，對(duì)人類健康和安全都有重要的意義。

圖3 傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和改良藥敏試驗(yàn)的流程圖Fig.3 Flow chart:The traditional antimicrobial sensitivity test and improved antimicrobial sensitivity test

對(duì)于K-B紙片擴(kuò)散法，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了多方面的研究。池云生［18］指出菌液濃度、培養(yǎng)基、紙片質(zhì)量等因素會(huì)影響細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的結(jié)果;王云霞［19］的研究也有類似的觀點(diǎn)。張彩芳［20］文章中對(duì)不同的瓊脂厚度、種類、濃度以及接種量等試驗(yàn)條件進(jìn)行了探究，提出為了減少各種因素的影響，應(yīng)實(shí)行方法的標(biāo)準(zhǔn)化。McGill等［21］對(duì)比了K-B紙片擴(kuò)散法和E-test方法測(cè)量結(jié)果的區(qū)別，Karaca等［22］對(duì)K-B紙片擴(kuò)散法與微量肉湯稀釋法測(cè)量細(xì)菌耐藥性的結(jié)果進(jìn)行比較。Lestari等［23］對(duì)人工和儀器測(cè)定抑菌圈的結(jié)果進(jìn)行比較。盡管目前已有許多研究針對(duì)于K-B紙片法，但有對(duì)于其系統(tǒng)性的改良以應(yīng)用于食源性致病菌的研究報(bào)道仍然較少。

本研究針對(duì)細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了改良和優(yōu)化，建立了一種基于傳統(tǒng)方法的改良藥敏試驗(yàn)方法。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)中麥?zhǔn)媳葷岱▽?duì)應(yīng)的是大腸埃希菌的濃度［12］，對(duì)于其他細(xì)菌濃度的判定可能會(huì)造成誤差，本研究用OD-菌數(shù)的對(duì)應(yīng)公式代替了傳統(tǒng)的麥?zhǔn)媳葷岱?，使獲得的副溶血性弧菌數(shù)更為準(zhǔn)確有效，且節(jié)省了16～18 h的單菌落培養(yǎng)時(shí)間。在培養(yǎng)皿的選擇上，本研究對(duì)玻璃平皿和一次性平皿的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了顯著性分析，結(jié)果表明兩者之間存在顯著差異(P＜0.05)。對(duì)于CLSI建議的棉拭子涂布方法提出了質(zhì)疑，由于不同廠家、不同工藝生產(chǎn)出的棉拭子大小、蓬松程度不同，并不能保證菌液用量的恒定，因此設(shè)計(jì)了3種涂布方法的對(duì)比，從而確定了定量300 μL的棉拭子涂布方法，此方法既存在較高的重復(fù)性又能節(jié)省涂布棒因反復(fù)灼燒而需要的時(shí)間。最后，對(duì)8株野生菌株的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明改良后的方法與傳統(tǒng)方法在測(cè)定結(jié)果上基本保持一致。

對(duì)比傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)，改良后的藥敏試驗(yàn)具有省時(shí)、省力、重復(fù)性好等特點(diǎn)，但本研究的不足之處在于只針對(duì)K-B紙片法的改良，希望后續(xù)研究將其應(yīng)用于藥敏試驗(yàn)的稀釋法和E-test法之中，從而對(duì)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)進(jìn)行更加完善的優(yōu)化。

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