狄盼盼，陳小兵，孫國偉，肖勁洲，潘迎捷

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮風(fēng)險評估重點實驗室，上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacca)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬(Eriocheir)［1］，又稱河蟹、毛蟹、清水蟹、大閘蟹或螃蟹，主要分布在亞洲北部、朝鮮西部和中國［2］。因其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，成為我國名貴的淡水養(yǎng)殖品種之一。我國中華絨螯蟹的養(yǎng)殖始于20世紀80年代，進入21世紀后其產(chǎn)業(yè)得到了迅猛發(fā)展，成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。江蘇、安徽、湖北、遼寧、天津等11個省市是我國的主要產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量超過49萬 t，年產(chǎn)值超過250億元［3］。近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅猛增長，蟹病害頻發(fā)，致使環(huán)境污染嚴重，養(yǎng)殖風(fēng)險增大，嚴重影響了該產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。尤其是病害高發(fā)問題已成為目前蟹養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸［4-5］。同時，水生動物的一些腸道內(nèi)的和經(jīng)腸道感染的重要疾病都往往與腸道細菌密切相關(guān)［6］，研究腸道細菌對這些疾病發(fā)生和病原菌入侵過程中的變化，有助于了解這些疾病的發(fā)生機理和探索疾病的防治途徑。同時，將水生動物腸道內(nèi)正常細菌和其他有益菌制成的益生菌劑投喂水生動物，可以維持健康、預(yù)防疾病、增強抗病免疫力，有利于水生動物的生長和繁殖［7］。目前，對腸道細菌群落的研究主要集中在人體和陸生大型哺乳動物［6，8-10］，水生動物的研究也多集中于魚類和蝦類［11-13］，而針對中華絨螯蟹腸道微生物的研究至今僅有1篇文章發(fā)表于2007年［12］。通過DGGE、16S rRNA克隆文庫以及Real-time PCR方法對池養(yǎng)和野生養(yǎng)中華絨螯蟹腸道內(nèi)微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)在腸道內(nèi)占有絕對優(yōu)勢。同時池養(yǎng)中華絨螯蟹腸道內(nèi)更多的是擬桿菌門，野生養(yǎng)中更多的是變形菌門。中華絨螯蟹腸道內(nèi)菌群數(shù)量為n×106～n×107/μL?；诜肿由飳W(xué)的方法雖然簡捷又高效，但培養(yǎng)獲得的微生物往往是環(huán)境生物群落中最能反映生態(tài)環(huán)境特征的類群。因此本研究采用分離培養(yǎng)技術(shù)和分子生態(tài)學(xué)手段相結(jié)合的方法，研究檢測養(yǎng)殖中華絨螯蟹腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌的菌群結(jié)構(gòu)，這不僅豐富了已有的中華絨螯蟹腸道微生物的研究，也促進了其更全面更深入的發(fā)展，對養(yǎng)殖中華絨螯蟹的益生菌開發(fā)和病害防治有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 中華絨螯蟹(2011年9月采自太湖3只健康雌性成蟹，平均體重150 g)。

1.1.2 實驗試劑 75%乙醇、0.01 mol/L PBS、甲醛、SYBR GreenI(索萊寶)、p-phenylenediamine、封片劑(或者無色指甲油)、細菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(天根)。

1.1.3 培養(yǎng)基 EMB和厭氧瓊脂(上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司);TSA、TCBS、腦心浸液(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 樣品先后用自來水、無菌水沖洗，75%乙醇體表消毒，于超凈臺內(nèi)無菌條件下解剖取出腸道，混于4 mL 0.01 mol/L PBS用無菌石英研磨棒研磨至勻漿，3 220×g離心2 min。小心吸取上清，梯度稀釋(1 mL菌液+9 mL PBS)，獲得原液及10－1、10－2、10－3和10－4梯度稀釋液，每個梯度3個平行，之后分別用于熒光染色計數(shù)和培養(yǎng)分離。

1.2.2 熒光染色計數(shù) 各梯度混勻后取1 mL過濾至0.22 μm濾膜。參考Patel等［14］方法，首先用甲醛對腸道細菌進行固定，而后用SYBR GreenI進行染色，用封片劑封片后即可在熒光顯微鏡下進行觀察。記錄結(jié)果后根據(jù)文獻內(nèi)提供的方法進行腸道菌群計數(shù)。

1.2.3 菌株分離培養(yǎng) 采用5種培養(yǎng)基TSA、TCBS、腦心浸液、EMB［15-16］和厭氧瓊脂，分別吸取100 μL涂布到相應(yīng)的平板培養(yǎng)基上TCBS涂布－1、－2梯度稀釋液，其余4種涂布－3、－4梯度稀釋液)，29℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)出的菌落用相機記錄其形態(tài)，并通過菌落形態(tài)進行初篩，選擇代表菌株用已滅菌的槍頭挑取適量菌落，依據(jù)細菌基因組提取試劑盒進行總基因組DNA的提取。

1.2.4 16S rRNA基因的PCR擴增 以制備的細菌基因組DNA為模板，27F(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')為引物，進行細菌16SrRNA的擴增。25 μL的PCR反應(yīng)體系中包含2.5 mmol/L的dNTP混合物2 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，10 μmol/L引物各1 μL，1 μL模板，1.5 U的TaqDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴增程序:95℃變性4 min，然后進入30個循環(huán):94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。遵循PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對擴增產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物測序(上海邁浦生物科技有限公司)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 首先運用Lasergene軟件的SeqMan子軟件，去除測序結(jié)果中的pGMT載體序列，檢查并完成拼接，拼接后的序列長度約1 500 bp。所得序列用RDP(Ribosomal Database Project)中的Classifer進行序列相似性比對并分類，閾值為95%;染色計數(shù)的數(shù)據(jù)用Excel進行統(tǒng)計學(xué)分析;分離培養(yǎng)菌株所測序列上傳至NCBI，獲得的登錄號為:KF953986－KF954029。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光染色計數(shù)

顯微鏡下觀察腸道細菌染色結(jié)果，如圖1。

圖1 中華絨螯蟹腸道細菌SYBR Green I熒光染色(1 000×)Fig.1 Epifluorescence-microscopy image of crab gut homogenate sample filtered onto a isoporeTM0.2 μm membrane filter stained with SYBR Green I(1 000×)

使用熒光顯微鏡的目鏡測微尺，參考Patel［14］的方法計數(shù)中華絨螯蟹腸道內(nèi)的菌群數(shù)量(n=3)，通過Excel分析，腸道內(nèi)細菌的數(shù)量為(2.5±0.9)×106/μL。

2.2 菌株分離培養(yǎng)

中華絨螯蟹腸道內(nèi)可培養(yǎng)菌的菌落形態(tài)如圖2所示，不同培養(yǎng)基所分離的細菌形態(tài)各異，直徑0.1～2 mm大小不等，顏色深淺不一，形狀有的規(guī)則，有的邊緣凹陷，表面有的干燥，有的有光澤，邊緣有的光滑，有的向四周凸起，有些中心厚四周薄，有些則是一側(cè)厚，從中挑選代表菌落測序。

圖2 中華絨螯蟹腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌的形態(tài)Fig.2 Morphology of the cultured bacteria of crab gut

2.3 克隆測序

根據(jù)菌落形態(tài)，共篩選了49株菌落送去測序，結(jié)果如表1所示，分為7個種系型(phylotype)。所有的類群都屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和腸桿菌科(Enterobacteriales)為優(yōu)勢菌群。

表1 中華絨螯蟹腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌多樣性Table1 Phylotypes of bacterial community in Chinese mitten crab intestines

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，熒光染色計數(shù)比較Li等人［12］的熒光定量PCR的結(jié)果略有偏低。結(jié)合樣品處理方法分析，此結(jié)果是合理的。每種方法都會或多或少受其自身的影響，熒光染色計數(shù)也不例外。樣品在過膜前必須通過離心將組織碎屑等除去，減少背景干擾，但同時附著在組織碎屑上的細菌也會被除去，因此過濾到膜上的細菌是少于中華絨螯蟹腸道的總菌量的。

池養(yǎng)中華絨螯蟹［12］腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群為擬桿菌門。而在本研究中，γ-變形菌綱成為中華絨螯蟹腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌的絕對優(yōu)勢種群。比較同樣采用分離培養(yǎng)法分析腸道微生物的研究結(jié)果，希瓦氏菌屬(Shewanella)、腸桿菌科、氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬等同樣曾在蝦類、魚類腸道中發(fā)現(xiàn)過［13，17-18］，特別是，假單胞菌屬和氣單胞菌屬為甲殼綱動物腸道內(nèi)常見菌屬。宛立等［17］從健康養(yǎng)殖的南美白對蝦腸道內(nèi)分離出111株細菌，這些分離菌株分別屬于13個屬(科)，其中就有假單胞菌屬、氣單胞菌屬，且氣單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬。王祥紅等［19］從野生健康中國對蝦成蝦腸道中分離出47株菌，其中包含假單胞菌屬、氣單胞菌屬，且假單胞菌屬為次優(yōu)勢菌屬。Moriarty等［20］的研究也表明甲殼類動物消化道中最常見的菌屬之一就是假單胞菌屬。

分離培養(yǎng)克隆測序法與直接克隆測序法所獲得的腸道菌群多樣性存在顯著差異，分析原因有以下幾個方面:①方法學(xué)本身的差異，這在以往蝦類腸道菌群的研究中也有發(fā)現(xiàn)。Eilers等［21］認為，只有改進培養(yǎng)方法和技術(shù)，才能縮小培養(yǎng)和分子方法在分析細菌群落上的差異，并認為這種差異很可能是因為只有那些具有快速生長潛力并能快速適應(yīng)含高濃度營養(yǎng)新環(huán)境的細菌才能在較短的時間在普通的培養(yǎng)基上形成菌落;②采樣的季節(jié)差異，不同季節(jié)，河蟹處于不同的生長階段，腸道內(nèi)發(fā)育狀況不同適合不同的菌群附著增殖，導(dǎo)致不同的優(yōu)勢菌群;③生長環(huán)境的差異、食物和營養(yǎng)的差異、養(yǎng)殖模式的不同使得蟹體腸道組織中菌群的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出差異性。

由此可見，每種方法都有其優(yōu)勢和弊端，不同條件下的中華絨螯蟹其腸道微生物組成也可能存在明顯差異。采用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、熒光原位雜交、DGGE等多種方法針對不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同生長階段和不同飼喂餌料下的中華絨螯蟹腸道菌群進行更全面更科學(xué)的研究。

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