梁 艷,劉振華,白清清,陳 虹

CYP2C19基因型與奧美拉唑治療消化道潰瘍療效的相關(guān)性

梁 艷1,劉振華1,白清清1,陳 虹2

目的 探討CYP2C19基因型與奧美拉唑治療消化道潰瘍的效果之間是否存在明確的相關(guān)性，以期為臨床用藥提供指導(dǎo)。方法 收集北京郊區(qū)二級醫(yī)院胃十二指腸潰瘍病史患者200例，使用基因組DNA快速提取試劑盒，采用Realtime-PCR方法，分析CYP450家族代謝酶的基因多態(tài)性；使用ABI7500fas型熒光定量PCR儀，對P450的6種基因型進行分析判讀，用直接計數(shù)法計算其基因型頻率及等位基因突變頻率，運用Hardy-Weinberg平衡定律對基因型分布吻合度進行檢驗，并對基因型間有無性別差異，等位基因突變頻率有無差異進行χ2檢驗。結(jié)果 服用奧美拉唑治療胃十二指腸潰瘍的效果與其基因型相吻合,慢代謝型患者使用奧美拉唑效果及pH值提高時間明顯優(yōu)于快代謝組；慢代謝組使用奧美拉唑效果更好。結(jié)論 北京郊區(qū)漢族人群P450家族代謝酶的三種基因類型間無性別差異，與歐洲白種人基因突變頻率存在明顯差異。其中，CYP3A4*18未檢出純合型突變，CYP450 2C19的基因型是影響奧美拉唑效果的重要因素。

CYP450; CYP2C19; 消化道潰瘍; 奧美拉唑

消化道潰瘍在我國人群中發(fā)病率高，復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥嚴重，是消化系統(tǒng)疾病中最常見的疾病之一，其治療主要包括抑制胃酸分泌、黏膜保護、胃腸動力藥及根除幽門螺桿菌等。奧美拉唑是目前針對消化道潰瘍應(yīng)用最早且最廣泛的有效藥物，在體內(nèi)經(jīng)肝細胞微粒體中CYP2C19代謝，催化生成羥基奧美拉唑而失去活性[1]?；枷罎兊牟煌瑐€體在使用奧美拉唑治療時，效果大相徑庭，有的患者在最大耐受劑量時仍不能控制病情，復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致如此巨大差異的因素有生理因素、病理因素、環(huán)境因素等，但經(jīng)大量孿生子研究和家系研究證明，遺傳因素才是導(dǎo)致個體和人群藥物反應(yīng)差異的決定性因素[2]。遺傳突變引起藥物反應(yīng)差異主要來自于編碼CYP2C19基因的基因多態(tài)性[3]。本研究選擇消化道潰瘍病史患者，檢測其CYP2C19*2、*3基因型，分析其與奧美拉唑療效相關(guān)性，可為個體化用藥提供理論及臨床依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 收集北京郊區(qū)二級醫(yī)院(長辛店醫(yī)院、大興醫(yī)院)2009-01至2012-09消化內(nèi)科患者300例，從中篩選出胃十二指腸潰瘍病史患者200例，年齡29～79歲，平均(57.63±1.52)歲，性別不限。排除標準：(1) 消化道腫瘤;(2)肝腎功能不全;(3)肝臟疾病及手術(shù)后;(4)合并嚴重心腦血管疾病服用多種藥物;(5)根據(jù)研究者判斷有可能增加患者危險的情況或者難于獲得實驗資料的情況;(6)不愿簽署知情同意書者。

1.2 主要試劑 PuxegeneDNA抽提試劑盒由Gentra公司提供，TaqDNA聚合酶及相關(guān)試劑、LATaqDNA聚合酶及相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶SSP1(TaKaRa Biotech公司)，限制性內(nèi)切酶 Sau3AI(Mbol)(New England Biolab公司)，DNAMarker(MBI公司)，瓊脂糖(BIOWEST公司), dNTP(Asngon), 引物合成(上海生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器 cenirifuge5415R冷凍變速離心機、BiophPtometer紫外分光光度儀、MastereyelerPCR儀(Eppendorf公司)。DYCP-31C型電泳儀(北京六一儀器廠)、VDS凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)、電子天平(Sartorius公司)、Vortex-2震蕩器(SI公司)、恒溫循環(huán)水浴箱(Helo公司)、微波爐、各規(guī)格微量加樣器及IMX藥物濃度分析儀(Abbott公司)。

1.4 血樣制備 采集肘靜脈血標本3 ml，加入含EDTA抗凝劑的真空抽血管中，輕顛倒數(shù)次混勻，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 外周血DNA提取 (1)取血樣300 μl，加入700 μl細胞裂解液于離心管中，上下顛倒離心5～6次混勻。室溫放置10 min，期間上下顛倒離心管2～3次，裂紅細胞；(2)使用低溫離心機以15 000 r/min，吸棄上清液；(3)使用渦旋振蕩器振蕩，使含白細胞的沉淀物重懸；(4)向重懸細胞溶液中加入300 μl核裂解液，立即使用加樣槍吹打使其充分混勻；(5)向核裂解物中加入RNA酶溶液1.5 μl,并上下顛倒離心管2～5次混勻，37 ℃孵育1 min，繼而冷卻至室溫；(6)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100 μl，用渦旋振蕩器振蕩15 s；(7)使用低溫離心機以15 000 r/min離心樣本3 min；(8)取上清液移至裝有300 μl異丙醇的離心管中；(9)輕輕顛倒以混勻溶液，至白色線狀DNA形成沉淀，15 000 r/min離心1 min；(10)棄去上清，加入75%乙醇300 μl，輕輕上下顛倒離心管數(shù)次，吸走乙醇溶液。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10～15 min；(11)向離心管中加入DNA溶解液100 μl；(12)所得DNA溶液于-80 ℃貯存?zhèn)溆?。用紫外分光光度計對DNA進行濃度和純度測定：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)。合格的標準為純度大于1.6小于2.0且濃度大于20 ng/μl。最后，標本統(tǒng)一調(diào)整為20 ng/μl，個別標本由于原液濃度在10～20 ng/μl，統(tǒng)一調(diào)整為10 ng/μl。

1.6 DNA擴增及基因分型

1.6.1 Real time-PCR引物設(shè)計 PCR引物設(shè)計目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與有效性。引物設(shè)計時應(yīng)遵循以下幾條基本原則[4]：(1)引物應(yīng)在核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性;(2)產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu);(3)引物長度一般在15～30個堿基;(4)G+C含量在40%～60%;(5)堿基要隨機分布;(6)引物5′端可以修飾;(7)引物3′端不可修飾;(8)引物3′端要避開密碼子的第3位。

通過輔助設(shè)計程序Primer對引物進行分析優(yōu)化，確定CYP2C9*3；CYP2C19*2；CYP2C19*3；CYP2D6*10；CYP3A4*18；CYP3A5*3 PCR引物(表1)。

表1 CYP2基因引物序列

1.6.2 探針設(shè)計 探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補區(qū)，而且熒光信號與擴增的拷貝數(shù)具有一一對應(yīng)的關(guān)系，因此特異性強靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易，探針的設(shè)計可以遵循以下幾條基本原則[5]：(1)探針位置盡可能地靠近上游引物;(2)探針長度應(yīng)在15→45 bp(最好是20→30 bp)，以保證結(jié)合特異性;(3)檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu);(4)Tm值在65→70 ℃，通常比引物Tm值高5→10 ℃，GC含量在40%→70%;(5)探針的5′端應(yīng)避免使用鳥嘌呤(G)，因為5′G有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用;(6)整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量(G含量高會降低反應(yīng)效率)，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。

在設(shè)計引物時應(yīng)該注意所選序列的特殊性和擴增目的片段是否有特殊要求，這種情況下要對上述原則作出某種程度上的修訂。選用的引物和熒光探針要求設(shè)計在基因中的保守區(qū)，只對特定基因、人特異，和其他物種無交叉反應(yīng);熒光探針位于一對引物之間的區(qū)域。對檢索的P450各個亞型序列，在引物設(shè)計軟件Primer Express的輔助下，設(shè)計出兩條熒光探針(表2)，各基因突變位點信息為CYP2C9*3，RS號1057910，突變位點編碼1075A>C；CYP2C19*2，RS號4244285，突變位點編碼681 G>A；CYP2C19*3，RS號4986893，突變位點編碼636 G>A；CYP2D6*10，RS號1065852，突變位點編碼100C>T；CYP3A4*18，RS號28371759，突變位點編碼878T>C；CYP3A5*3，RS號1065852，突變位點編碼6986A>G。

表2 CYP2基因檢測探針序列

1.6.3 PCR反應(yīng)體系 PCR Master Mix購自上海超世生物科技公司。PCR Master Mix包含了經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液、dNTP、化學(xué)修飾的Taq CE DNA聚合酶和MgCl2溶液混合液，使用時只需加入適量的引物、探針和待檢測樣品，即可進行Real-time PCR檢測[6]。

PCR Master Mix使用化學(xué)修飾、去核酸酶、去甲基化的Taq CE DNA聚合酶和MgCl2溶液混合物，為PCR反應(yīng)提供了更高的產(chǎn)量及靈敏度、特異性。能夠檢測低至10個拷貝的目的基因，并最終產(chǎn)生高達7個數(shù)量級的動態(tài)范圍結(jié)果[7](表3)。

表3 25 μl反應(yīng)體系內(nèi)容

1.6.4 PCR反應(yīng)條件 將各反應(yīng)管放入ABI7500 fast 熒光定量PCR儀，按下列條件擴增：95 ℃,10 min，然后按95 ℃10 s→60 ℃45 s，40個循環(huán)。50 ℃2 min，95 ℃10 min，然后按95 ℃15 s→60 ℃1 min，50個循環(huán)。

1.7 結(jié)果分析條件設(shè)定 ABI7500 fast基線設(shè)定：選擇“適合基線(adaptive baseline)”設(shè)定時的熒光信號。閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點為準[8]。結(jié)果判讀[9]:(1)陰性結(jié)果判定：如果增長曲線不呈S形曲線或Ct值>35，則待測樣品判定為陰性；(2)陽性結(jié)果判定：如果增長曲線呈S形曲線且Ct值>35，則實驗結(jié)果判為陽性。以上判定標準如果任何一條不符合, 需重復(fù)實驗一次，若重復(fù)實驗結(jié)果顯示為增長曲線呈S形曲線且Ct值≤35，則判為陽性；否則判定為陰性。三種基因型熒光定量PCR檢出結(jié)果(圖1)。

圖1 基因型熒光定量PCR檢出結(jié)果

1.8 結(jié)果驗證 按照上述方法及步驟用同一樣本進行PCR擴增，反應(yīng)體系中不加入對應(yīng)探針，只進行PCR擴增。擴增反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)EP管從ABI7500機器中取出于4 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物使用ABI 3730型測序儀進行序列測定[10]，讀取PCR產(chǎn)物序列。

使用測序所得結(jié)果與Realtime-PCR方法所得結(jié)果一致。結(jié)果準確性為100%，未出現(xiàn)漏檢錯檢。

1.9 服用奧美拉唑后療效

1.9.1 分組 選取經(jīng)過CYP450 2C19基因檢測的胃十二指腸潰瘍患者入組，分為快代謝組(n=160)和慢代謝組(n=40)，給予奧美拉唑(洛賽克，20 mg/粒，阿斯利康公司生產(chǎn))口服治療，1粒/d，早餐前服用，療程為4周，服用藥物前及服用藥物后1周、2周、3周、4周分別觀察其療效。

1.9.2 觀察指標 包括pH值、腹痛、反酸、腹脹和噯氣。醫(yī)師于用藥前和用藥的第1～4周對患者的pH值及上述癥狀進行檢測評價。腹痛嚴重程度評分標準：0分：無腹痛；1分：輕度，患者需注意方能察覺有腹痛；2分：中度，有腹痛，但不影響生活；3分：重度，腹痛影響日常生活。其他癥狀記錄的標準為有或無。

1.9.3 療效評價 包括pH值、腹痛消失率(腹痛完全消失的比率)和腹痛緩解率(其嚴重程度的評分減少，但未完全消失的比率)。其他癥狀只評價是否完全消失率。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 服用奧美拉唑200例，慢代謝組(CYP2C19*2/*3、*2/*2、*3/*3)入組40例；快代謝組(CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3)入組160例。治療前患者存在腹痛、反酸、噯氣和腹脹等癥狀及腹痛嚴重程度記分無明顯差異。治療后癥狀變化：服用奧美拉唑治療胃十二指腸潰瘍患者中，各組間每周的pH值及腹痛消失比率有顯著差異，慢代謝組用藥第1周pH值為3.8，腹痛緩解率為48%，至第4周pH值提高至5.6，腹痛緩解率為98%。在第1周，快代謝組的pH值為3.5，腹痛緩解率為47%；第4周pH值在4.9，腹痛緩解率為85%，明顯低于慢代謝組(P<0.05)。慢代謝組的腹脹和噯氣緩解率在用藥第4周為95%，快代謝組為81%。用藥期間兩組患者最終的緩解率有明顯差異。服用奧美拉唑治療胃十二指腸潰瘍的效果與其基因型相吻合，慢代謝型患者使用奧美拉唑效果及pH值提高時間明顯優(yōu)于快代謝組(表4)。慢代謝組使用奧美拉唑效果更好。

2.2 CYP450各基因型比例和等位基因頻數(shù) 檢測300例患者CYP450基因結(jié)果如下：CYP2C9基因野生型純合子AA型為276例(92%)，雜合子AC型為10例(7%)，突變型純合子CC型為14例(1%)，A、C等位基因頻率分別為99%和1%。 CYP2C19*2野生型純合子GG型為276例(56%)，雜合子GA型為10例(37%)，突變型純合子AA型為14例(7%)，G、A等位基因頻率分別為93%和7%；CYP2C19*3野生型純合子GG型為276例(88.8%)，雜合子GA型為10例(11.1%)，突變型純合子AA型為14例(0.1%)，G、A等位基因頻率分別為99.9%和0.01%；CYP2D6*10野生型純合子CC型為276例(27%)，雜合子CT型為10例(46%)，突變型純合子TT型為14例(27%)，C、T等位基因頻率分別為73%和27%；CYP3A4*18野生型純合子TT型為276例(96.8%)，雜合子TC型為10例(3.4%)，突變型純合子CC型為14例(0%)、T、C等位基因頻率分別為96.8%和3.4%；CYP3A*3野生型純合子AA型為276例(8.5%)，雜合子AG型為10例(27.5%)，突變型純合子GG型為14例(64%)。A、G等位基因頻率分別為36%和64%。均符合Hardy-Weinberg平衡遺傳定律(P>0.05)。

表4 消化性潰瘍患者基因與藥物代謝差異數(shù)據(jù)比較

3 討 論

CYP分為18個家族和44個亞家族，CYP450以CYP1、CYP2和CYP3為主，各有8～10個亞家族同工酶，這3種CYP450占肝內(nèi)CYP450總量的70%，介導(dǎo)人體內(nèi)絕大多數(shù)藥物(外源性化合物)的代謝。其中CYP3A占的比例最大，約占肝內(nèi)CYP450總量的30%，其次是CYP2，約20%；CYP1A2占13%；CYP2E1占7%；CYP2A6占4%；CYP2D6占2%。研究發(fā)現(xiàn)，這些酶的活性在個體間存在很大差異，有的可以達到100倍，其中CYP450酶基因多態(tài)性因素是造成P450活性個體間差異的主要因素，但與性別無關(guān)。

本研究表明，北京郊區(qū)漢族人群P450家族代謝酶 CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP3A4*18、CYP3A5*3的基因存在多態(tài)性，各基因型分布規(guī)律不同。3種基因類型間無性別差異。樣本具有種群代表性，與歐洲白種人基因突變頻率存在明顯差異。其中CYP3A4*18未檢出純合型突變，3A4*18基因不是造成3A4酶活性改變的因素。

奧美拉唑治療效果與其基因型相吻合，CYP450 2C19的基因型是影響奧美拉唑效果的重要因素。本研究結(jié)果說明CYP2C9*3、 CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP3A4*18、CYP3A5*3基因型，從分子水平探討與CYP450相關(guān)的藥物相互作用，并分析CYP450酶基因分布規(guī)律，能夠設(shè)計出適合不同個體特點的用藥及配伍，最大限度地提高藥物的有效性和安全性。

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(2013-10-19收稿 2013-12-09修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Correlative studies on CYP2C19 with peptic ulcer patients using omeprazole

LIANG Yan1，LIU Zhenhua1，BAI Qingqing1，and CHEN Hong2.

1. Department of Pharmacy, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162，China

Objective To study CYP2C19*2 and *3 genotype with peptic ulcer patients using omeprazole in order to confirm therapeutic effect on CYP2C19 genotype with omeprazole whether there is a clear correlation and to guide clinical drug use. Methods 200 patients with gastroduodenal ulcer disease from Beijing outskirts secondary hospital were recruited, genomic DNA quick extraction kit and realtime-polymerase chain reaction (PCR) were used,the family of CYP450 gene polymorphism of metabolic enzymes was analyzed,ABI7500fas type fluorescent quantitative PCR was employed.Six genotypes of the P450 were analyzed , direct counting method was used to calculate the mutation genotype frequency and allele frequency. Hardy Weinberg of genotype distribution law was used to examine alignment and the presence of gender differences between genotypes and alleles mutation frequency difference by chi-square test. Results The effect of omeprazole treating gastroduodenal ulcer coincides with its genotype, the effect of omeprazole in patients with slow metabolism and pH increase time were remarkably better than patients with quick metabolism. Conclusions P450 family metabolic enzymes of the Han people in suburb Beijing have gene polymorphisms,but no gender differences between three types of gene.There exists obvious difference in the white European gene mutation frequency, and in CYP3A4*18 the homozygous mutations are not detected , 3A4*18 gene is not the main factor of 3A4 enzyme activity change. Omeprazole treatment effect is consistent with its genotype, CYP450 2C19 genotype is an important factor affecting the effects of omeprazole.

CYP450; CYP2C19; peptic ulcer; omeprazole

武警總醫(yī)院苗圃基金(WZ2011046)

梁 艷，碩士，副主任藥師，E-mail: ly.w.j@163.com

1.100039北京，武警總醫(yī)院藥劑科；2.300309天津，武警后勤學(xué)院臨床藥理教研室

陳 虹，E-mail: chenhongtian06@163.com

R573.1