趙靜， 錢鐳， 劉鵬

(1.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱 150086；2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028)

0 引 言

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，抗菌活性強(qiáng)，主要作用于革蘭氏陰性菌，常用于治療細(xì)菌感染，又因其廉價(jià)易得而得到廣泛的應(yīng)用[1-4]中國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)動(dòng)物性食品中慶大霉素殘留的檢測(cè)采用的是高效液相色譜法，以O(shè)PA為衍生劑進(jìn)行柱后衍生[5]，但方法的重復(fù)性較差，靈敏度較低，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，由于OPA本身穩(wěn)定性較差[6-8]，衍生化試劑需臨時(shí)配制，且衍生產(chǎn)物也較易發(fā)生分解[9-11]。因此，為了方便乳及乳制品中抗生素殘留的日常監(jiān)測(cè)，需要建立能夠快速測(cè)定慶大霉素的簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。

本研究采用相對(duì)穩(wěn)定的氯甲酸芴甲酯為衍生劑，進(jìn)行柱前衍生，并對(duì)衍生條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在建立一種能同時(shí)提取并凈化原料奶中慶大霉素的前處理方法，以期建立簡(jiǎn)單，快速的慶大霉素殘留檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站，配Waters2475熒光檢測(cè)器；QL-901型振蕩器；Oasis MCX (mixed-modecation exchange)固相萃取柱；電子天平；離心機(jī)；氮吹儀；水浴鍋；酸度計(jì)等。

1.2 材料試劑

慶大霉素標(biāo)物質(zhì)(≥99%)：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；乙腈(色譜純),天津科密歐公司；正己烷；庚烷磺酸鈉；氫氧化鉀；硼酸；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；氯化鈉；三氯乙酸；氯甲酸芴甲酯；甘氨酸；實(shí)驗(yàn)用水均為三級(jí)水；

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.050mg,甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中,搖勻，配成質(zhì)量濃度為1.000 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，使用時(shí)按需要制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30℃；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器；激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm；流動(dòng)相：乙腈-水(75:25,V/V)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 樣品預(yù)處理

取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL于指形瓶中，加入2 mL 0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液，加入0.4 mL氯甲酸芴甲酯衍生試劑，震蕩，暗處反應(yīng)30 min，加入120 μL的甘氨酸溶液終止反應(yīng)，待上機(jī)分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次稀釋為5，25，50，75，100，200，500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液， 柱前衍生化處理后，取10 μL進(jìn)樣，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度水平為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物色譜圖的平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 方法的專屬性

將空白輔料溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液按樣品預(yù)處理方法項(xiàng)操作，分別進(jìn)樣10 μL，獲得相應(yīng)的色譜圖。

1.3.5 精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定

分別在同一天和連續(xù)5 d測(cè)定質(zhì)量濃度為25，100，500 mg/L的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，根據(jù)日內(nèi)與日間變異系數(shù)評(píng)價(jià)方法的精密度和準(zhǔn)確度。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

慶大霉素供試品溶液經(jīng)過(guò)樣品處理衍生后，每隔2 h進(jìn)樣一次，每次進(jìn)3針。

1.3.7 方法回收率實(shí)驗(yàn)

空白輔料中加入質(zhì)量濃度分別為25，100，500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行 5個(gè)樣本分析，取10 μL進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)的峰面積。

1.3.8 靈敏度考察

向空白輔料中添加不同濃度的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比S/N=3時(shí)的最低質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限，S/N=10時(shí)的最低質(zhì)量濃度為最低定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

C18和C8色譜柱均可用于慶大霉素的檢測(cè)[12]，本實(shí)驗(yàn)采用C18柱。調(diào)整流動(dòng)相乙腈與水的比例發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈比例的減少，慶大霉素出峰的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，出峰時(shí)間過(guò)早不利于慶大霉素殘留的充分檢出，可能會(huì)有雜質(zhì)干擾，出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)，綜合考慮，選擇乙腈與水的最優(yōu)比例為75:25，不僅可以排除雜質(zhì)的干擾，同時(shí)可在較短的時(shí)間內(nèi)將慶大霉素檢測(cè)出來(lái)。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

本研究中對(duì)不同的衍生條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液濃度為0.4 mol/L，pH值為12.0，衍生時(shí)間30 min時(shí)，可以到達(dá)最高的響應(yīng)值。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將稀釋以后的慶大霉素溶液，分別上機(jī)測(cè)定，以得出的峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，上機(jī)所用慶大霉素溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法的專屬性

在上述色譜條件下，空白、加標(biāo)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜如圖2～圖4所示。由圖4可以看出，慶大霉素的保留時(shí)間是5.18 min，圖2和圖3說(shuō)明空白樣品中的物質(zhì)對(duì)慶大霉素的檢測(cè)沒(méi)有干擾。

圖2 空白奶樣色譜

圖3 空白奶樣加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖4 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜

2.5 精確度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

分別選取了高、中、低三個(gè)濃度梯度的慶大霉素溶液，做日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，該方法準(zhǔn)確度良好，精確度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

慶大霉素供試溶液每隔2 h進(jìn)樣一次，結(jié)果表明8 h內(nèi)可獲得穩(wěn)定的測(cè)定結(jié)果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.25%，穩(wěn)定性良好。

表1 慶大霉素在牛奶中的精密度和準(zhǔn)確度

2.7 方法回收率實(shí)驗(yàn)

向空白牛奶中加入標(biāo)準(zhǔn)慶大霉素溶液，使慶大霉素質(zhì)量濃度為25，50，100 mg/L，并上機(jī)測(cè)定，得出方法回收率如表2所示。

表2 牛奶中慶大霉素的方法回收率

2.8 靈敏度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)信噪比(S/N)的值來(lái)確定最低定性檢測(cè)限和最低定量檢測(cè)限，結(jié)果表明該方法最低定性檢出限為0.15 mg/L，定量檢出限為0.35 mg/L。

3 討 論

本研究以乙腈與水為流動(dòng)相，采用FMOC-Cl為衍生劑進(jìn)行衍生，利用C18色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)，可以較好地檢測(cè)出慶大霉素。該檢測(cè)方法中衍生條件溫和，可在室溫條件下操作，無(wú)需進(jìn)行水浴加熱，降低了衍生溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并且衍生物穩(wěn)定性較好，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8 h，同時(shí)該方法靈敏度較高，最低定量檢測(cè)限為0.35 mg/L，定性檢測(cè)限為0.15 mg/L，所以該方法更適合乳中慶大霉素的檢測(cè)。

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