姜勇，呂學(xué)娜，安玉枝，王錫青

(圣元營養(yǎng)食品有限公司，山東 青島266400)

0 引 言

雙歧桿菌 (Bifidobacterium)是人體腸道內(nèi)數(shù)量最多、功能最重要的益生菌，革蘭氏陽性、無芽胞，通過定植于腸黏膜上皮細(xì)胞表面，形成一個生物學(xué)屏障，阻止和抑制各種致病菌與條件致病菌在腸道的定植、入侵和生長繁殖[1]。阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種有周生鞭毛、能運(yùn)動、無芽孢、兼性厭氧的革蘭氏陰性致病菌。新生兒感染該菌可導(dǎo)致腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥，感染引起的死亡率高達(dá)50%以上[2，3]。目前國家嬰兒配方食品標(biāo)準(zhǔn)GB 10765中規(guī)定阪崎腸桿菌的限量為0/100g[4]，指定的檢測方法為GB 4789.40[5]；對添加活性菌種的產(chǎn)品規(guī)定為活性益生菌數(shù)應(yīng)≥106CFU/g(mL)[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道益生菌對腸道致病菌有抑制作用[6，7]，其作用機(jī)理主要在于競爭性抑制或生長代謝過程中產(chǎn)生某些抑菌物質(zhì)[8-10]。本研究的目的在于考察按照GB 4789.40檢測阪崎腸桿菌，雙歧桿菌的存在是否會影響檢測結(jié)果；在證實(shí)抑制作用存在后，對檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料A：雙歧桿菌(BI-07，1011g-1)；樣品A：嬰兒配方奶粉(添加BI-07，107g-1)；樣品B：嬰兒配方奶粉(與樣品A的差別僅在于未添加BI-07)。阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 51329)，緩沖蛋白胨水(BPW)，改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(mLST)，阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，MRS培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯，萬古霉素，莫匹羅星鋰鹽。API 20 E腸桿菌和其他革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺式高速離心機(jī)，BBL CrystalTMSpec比濁計(jì)，LRH-150F生化培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌的檢測

按GB 4789.40進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢測[5]，檢測程序如圖1所示。

1.3.2 雙歧桿菌的計(jì)數(shù)

按GB 4789.35進(jìn)行雙歧桿菌的計(jì)數(shù)[11]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)菌懸液的制備

阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)復(fù)活后轉(zhuǎn)接營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h后，離心該培養(yǎng)液10 min(2 000轉(zhuǎn)/min)，棄去上清液。用10 mL無菌生理鹽水振蕩洗滌菌體，離心10 min(2 000 r/min)，棄去上清液。如此洗滌離心操作2次，再加10 mL無菌生理鹽水混勻，配制成菌懸液。用濁度計(jì)測量麥?zhǔn)蠞岫炔碐B4789.2進(jìn)行計(jì)數(shù)[12]。以上操作均為無菌操作。

圖1 GB 4789.40阪崎腸桿菌檢測程序

以菌懸液濃度對相應(yīng)的濁度值作圖，得菌液濃度與濁度關(guān)系曲線(圖2)。在之后的實(shí)驗(yàn)中，通過測定所制備的菌懸液的濁度，從而查得菌液濃度，然后根據(jù)所需菌液濃度用無菌生理鹽水做梯度稀釋。

圖2 菌液濃度與濁度關(guān)系曲線

1.3.4 阪崎腸桿菌陽性對照的檢測

在按GB 4789.40程序進(jìn)行檢測的第一步，即100 g檢樣加入900 mL BPW稀釋液的同時，加入一定量已知濃度的阪崎腸桿菌菌懸液，然后再按照后續(xù)步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉的檢測

對表1所列檢樣進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢測。其中在樣品A阪崎腸桿菌陽性對照1和樣品B阪崎腸桿菌陽性對照1中分別加入濃度為100 mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為0.01 g-1；在樣品A阪崎腸桿菌陽性對照2和樣品B阪崎腸桿菌陽性對照2中分別加入濃度為101mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為0.10 g-1，檢測結(jié)果如表1所示。

由結(jié)果分析可知，當(dāng)嬰兒配方奶粉中雙歧桿菌含量為107g-1時，可以對含量為10-2g-1的阪崎腸桿菌產(chǎn)生抑制，從而使檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性；而當(dāng)阪崎腸桿菌含量增至10-1g-1時，不能被完全抑制，檢測結(jié)果呈陽性。因?yàn)閲覙?biāo)準(zhǔn)對嬰兒配方食品中阪崎腸桿菌的限量值為每100 g不得檢出，所以當(dāng)含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉中，阪崎腸桿菌含量在10-2g-1水平時，按GB 4789.40進(jìn)行檢測存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 雙歧桿菌原料的檢測

對表2所列檢樣進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢測。因?yàn)殡p歧桿菌在原料A中的含量為1011g-1，在樣品A中的含量為107g-1，按此比例計(jì)算原料A在樣品A中的添加量為1/1 000；若阪崎腸桿菌在樣品A中的含量分別為10-2g-1和10-1g-1水平，且全部來源于原料A，則其在原料A中的含量分別為102g-1和103g-1。因此在原料A阪崎腸桿菌陽性對照1和空白阪崎腸桿菌陽性對照1中分別加入104mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為102g-1；在原料A阪崎腸桿菌陽性對照2和空白阪崎腸桿菌陽性對照2中分別加入105mL-1的阪崎腸桿菌菌懸液1 mL，折算到檢樣中的含量分別為103g-1，檢測結(jié)果如表2所示。

由結(jié)果分析可知，當(dāng)原料中雙歧桿菌含量為1011g-1時，可以對含量為102g-1和103g-1的阪崎腸桿菌產(chǎn)生抑制，從而使檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性；而其對應(yīng)的產(chǎn)品檢測結(jié)果分別為假陰性和陽性?？梢姴捎肎B 4789.40作為雙歧桿菌原料中阪崎腸桿菌的檢測方法時，也存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 抑制機(jī)理研究

根據(jù)GB 4789.40檢測程序，阪崎腸桿菌的檢測過程中存在兩步增菌，第一步先用BPW(緩沖蛋白胨水)增殖腸道菌，第二步再用mLST-Vm(改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素)選擇性增殖革蘭氏陰性腸道菌，其中加入萬古霉素的作用就是選擇性抑制革蘭氏陽性菌，而雙歧桿菌是革蘭氏陽性菌，理應(yīng)在此步中被抑制，因此雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用很有可能發(fā)生在第一步增菌過程。為驗(yàn)證此推斷，在第一步增菌后，省略第二步增菌，直接劃阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，并進(jìn)行后續(xù)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由此可見，省略第二步增菌后的檢測結(jié)果與之前的檢測結(jié)果是一致的，證實(shí)雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用發(fā)生在第一步增菌過程。

表1 含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測結(jié)果 g-1

表2 含雙歧桿菌的原料的阪崎腸桿菌檢測結(jié)果 g-1

表3 省略第二步增菌后的阪崎腸桿菌檢測結(jié)果

分別對樣品A和原料A在第一步增菌前后的雙歧桿菌含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表4所示。由表中數(shù)據(jù)可以看出，雖然從微生物學(xué)角度來說雙歧桿菌并未顯著增殖，但是對于如此高濃度的初始菌含量，可以通過占優(yōu)勢的雙歧桿菌的競爭性代謝活動，迅速消耗第一步增菌培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而極大程度的抑制處于弱勢的阪崎腸桿菌的生長繁殖。

表4 增菌前后雙歧桿菌的含量 mL-1

表5 方法改進(jìn)后阪崎腸桿菌的檢測結(jié)果

2.4 檢測方法改進(jìn)

檢測方法的改進(jìn)，主要從如何抑制雙歧桿菌的生長，促進(jìn)阪崎腸桿菌的增殖兩方面考慮。可以通過添加選擇性抑制劑，或增大稀釋液的用量以降低雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用等方法來實(shí)現(xiàn)。在第一步增菌過程中，分別考察在BPW中加入萬古霉素(終質(zhì)量濃度為10 mg/L)和增大BPW稀釋液用量至1∶100；對含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料的阪崎腸桿菌陽性對照樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。

由結(jié)果分析可知，在BPW中加入終質(zhì)量濃度為10 mg/L萬古霉素，可以避免雙歧桿菌含量為107g-1的嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測結(jié)果的假陰性；而對雙歧桿菌含量為1011g-1的原料，檢測結(jié)果仍為假陰性，可能是因?yàn)殡p歧桿菌含量太高所致。增大BPW稀釋液用量至1∶100，對含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料的阪崎腸桿菌的檢測，均可避免結(jié)果的假陰性。

3 結(jié) 論

本課題的研究表明，對于含雙歧桿菌的嬰兒配方奶粉和原料，按照GB 4789.40進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢測，檢測結(jié)果存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)。通過添加萬古霉素，或增大BPW稀釋液的用量，可以降低雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制作用，從而避免檢測結(jié)果的假陰性，保證產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。而雙歧桿菌對阪崎腸桿菌的抑制限需做進(jìn)一步研究；萬古霉素的添加量、BPW稀釋液的使用量也需進(jìn)一步優(yōu)化。

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[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.35-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)[S].2010.

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定[S].2010.