蘇晉文，李志成，任嬌，郝潔，付芒娟

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100)

0 引 言

抗菌肽是存在于生物體內(nèi)能抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類由基因編碼或經(jīng)大分子蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子多肽[1]，具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、和寄生蟲的活性，且不易產(chǎn)生耐藥性[2-3]，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕镔|(zhì)。

乳酪蛋白在酶解過程中可以產(chǎn)生多種生物活性肽[4-5]，在牛乳酪蛋白酶解物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽[6-8]。山羊乳是北方僅次于牛乳的第二大乳源，山羊乳酪蛋白和牛乳酪蛋白在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基酸序列等方面存在較大差異[9-11]，以山羊乳酪蛋白為原料同樣能獲得多種活性肽[12-13]。目前對山羊乳酪蛋白抗菌肽的研究鮮見報(bào)道。本研究以山羊乳酪蛋白為原料，探索山羊乳酪蛋白抗菌肽的最適酶解條件，為山羊乳的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無抗山羊乳，購于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧場；沙門氏菌(Salmonella LT2)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26111)、大腸桿菌(Escherichia coli ACTT25922)，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保存。

考馬斯亮藍(lán)G-250，胰蛋白酶(80 000 U/g)，堿性蛋白酶(8 000 U/g)，木瓜蛋白酶(40 000 U/g)，中性蛋白酶(40 000 U/g)，胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700雙光束紫外光分光光度計(jì)，PK121R型低溫冷凍離心機(jī)，水浴鍋，SB5200DT超聲清洗機(jī)，ES315高壓蒸汽滅菌鍋，PYX-DHS-40×50-BS-П隔水式恒溫培養(yǎng)箱(HES-380)；SW-CJ-1F超凈工作臺。

1.3 乳酪蛋白制備

新鮮無抗山羊乳4℃條件下，5 000 r/min離心20 min脫脂，離心后的溶液用濃度為2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.3，在40℃水浴鍋中靜置30 min沉淀酪蛋白，沉淀完全后5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用濃度為50 mmol/L(pH=4.4)HAc-NaAc緩沖液洗滌所得沉淀2～3次，洗滌后5 000 r/min離心10 min，即得酪蛋白粗品。

1.4 酪蛋白酶解液制備

稱取適量酪蛋白于三角瓶，加濃度為0.1 mol/L的NaOH助溶，定容，沸水浴加熱10 min，殺菌。冷卻后，放入60℃的恒溫水浴鍋中，等到酶解液溫度與水浴鍋溫度一致，調(diào)節(jié)溶液pH值至最適，并準(zhǔn)確加入蛋白酶。水解過程不斷滴加濃度為1 mol/L的NaOH，維持反應(yīng)體系pH值恒定，到達(dá)規(guī)定酶解時(shí)間后，沸水浴加熱滅酶10 min，冷卻離心，取上清液備用[14]。

1.5 蛋白酶的篩選

[15]和[16]中的方法，分別采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶在表1所示的條件下酶解山羊乳酪蛋白，根據(jù)酶解液對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌抑菌圈直徑大小篩選出抑菌效果最好的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.6 酶解條件優(yōu)化

1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)時(shí)間的確定。在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，加酶量為 4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，以時(shí)間為0.5 h和1.5～5.5 h做單因素實(shí)驗(yàn)，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶解時(shí)間。

(2)加酶量的確定。選用適宜酶解時(shí)間，在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，底物質(zhì)量濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，按 2 000 U/g和3 000～7 000 U/g加入木瓜蛋白酶，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶用量。

(3)底物質(zhì)量濃度的確定。選用適宜酶用量和酶解時(shí)間，分別在底物質(zhì)量濃度為4，6，8，10，12 g/L的條件下酶解酪蛋白，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜底物質(zhì)量濃度。

(4)pH值的確定。選用適宜酶用量、酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度，分別在pH值為3，4，5，6，7和8條件下進(jìn)行酶解，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶解pH值。

1.6.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最適條件，以底物濃度、加酶量、pH值、酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，按照L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以酶解液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，確定木瓜蛋白酶酶解羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。

1.7 檢測指標(biāo)及方法

1.7.1 酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

采用微量凱氏定氮法[17]測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測得山羊乳酪蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.78%。

1.7.2 抑菌活性測定

本研究指示菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

(1)培養(yǎng)基制作。稱取牛肉膏5.00 g，胰蛋白胨10.00 g，NaCl為5.00 g， 瓊脂10～12 g， 蒸餾水加熱溶化，冷卻，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4。

(2)菌種活化。無菌操作條件下用接種環(huán)將斜面保藏的菌種接種于滅好菌的營養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)接種兩代，于4℃冰箱中備用。

(3)菌懸液的制備及活菌計(jì)數(shù)。無菌條件下，用生理鹽水將活化的菌種從斜面洗下，震蕩均勻進(jìn)行逐級稀釋，取100 μL進(jìn)行平板涂布，37℃倒置培養(yǎng)培養(yǎng)16～24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算原液濃度。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。 將原液按2，3，4，6，8，9，10，50，100的倍數(shù)稀釋，在560 nm處測定各稀釋液OD值，以不同稀釋度的菌落數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度，調(diào)整菌液濃度最終為107mL-1，3種菌吸光值與菌液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

(5)抑菌活性測定

參考文獻(xiàn)[18]和[19]中的方法，測定試樣對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑。具體方法為：在無菌條件下，取107mL-1的菌液100 μL均勻涂布于營養(yǎng)培養(yǎng)基上，在超凈工作臺中靜置20 min，待菌液吸收后用無菌的外徑為8 mm的小鋼管在瓊脂平板上挖洞，每孔加入90 μL樣品溶液，水平置于4℃冰箱中約2 h讓樣品溶液完全擴(kuò)散，再移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～24 h，觀察結(jié)果，有抑菌圈出現(xiàn)的樣品，以游標(biāo)卡尺量其取抑菌圈的直徑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)的形式表示，每組試驗(yàn)進(jìn)行3～6個(gè)重復(fù)，必要時(shí)進(jìn)行方差顯著性比較。

2 結(jié)果分析

2.1 山羊乳酪蛋白水解酶的篩選

5種蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白酶解液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最佳抑菌效果見表2。

由表2可以看出，陽性對照青霉素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有顯著抑制作用，堿性蛋白酶酶解物對大腸桿菌，中性蛋白酶酶解物對沙門氏菌，胰蛋白酶酶解物對金黃色葡萄球菌均無抑菌活性。相比而言，木瓜蛋白酶酶解物對3種菌的抑菌效果均較好，與其他四種酶解物對3種菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異(P<0.05)。因此，確定木瓜蛋白酶為山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶。

圖1 菌液吸光值與其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

注：青霉素質(zhì)量濃度為1 250 mg/L；小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)；瓊脂孔直徑8.0 mm；-為沒有抑菌圈。

菌株大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌中性蛋白酶酶解物8.2±0.1c―8.3±0.2c胰蛋白酶酶解物8.4±0.2c 8.2±0.2c―木瓜蛋白酶酶解物9.3±0.2b 9.4±0.1b 9.4±0.3b抑菌圈直徑/mm菌株大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌堿性蛋白酶酶解物―8.4±0.1c 8.3±0.2c胃蛋白酶酶解物8.6±0.1c 8.5±0.2c―生理鹽水―――青霉素40.3±0.5a 43.3±0.5a 43.0±1.0a抑菌圈直徑/mm

2.2 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間

在酶解溫度為60℃，pH 值為5.5，加酶量為4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，改變酶解時(shí)間，不同酶解時(shí)間對酶解液抑菌效果的影響結(jié)果如圖2。

圖2 時(shí)間對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖2可以看出，在2.5 h之前，隨著時(shí)間的延長，酶解液對3種菌的抑菌圈直徑逐漸增大，說明酶解時(shí)間小于2.5 h，酪蛋白沒有被完全水解，隨著水解時(shí)間的延長水解度增加，具有活性的多肽濃度不斷升高；而2.5 h之后，抑菌圈的直徑隨時(shí)間延長而減小，可能是因?yàn)槔业鞍妆煌耆夂?，具有抑菌活性的多肽被繼續(xù)酶解成不具抗菌活性小肽，使原來生成的抗菌肽的量減少。2.5 h時(shí)抑菌效果達(dá)到最高，說明此時(shí)酶解液中抗菌肽濃度最高，為最佳酶解時(shí)間。

2.2.2 加酶量的影響

在給定條件酶解溫度60℃，底物質(zhì)量濃度60 g/L，酶解時(shí)間2.5 h，pH值為5.5時(shí)，加酶量對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖3所示。

圖3 加酶量對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖3可以看出，加酶量在2 000～5 000 U/g之間，酶解液對3種菌的抑菌圈直徑隨加酶量的增加而增大，在5 000 U/g之后，抑菌圈直徑隨加酶量的增加而減小。加酶量在5 000 U/g之前，隨著酶用量的增加，酶與底物的比例逐漸增大，單位時(shí)間內(nèi)木瓜蛋白酶結(jié)合酪蛋白并催化反應(yīng)生成的抗菌肽的量也逐漸增多；在5 000 U/g之后，隨著加酶量的增大，體系內(nèi)開始形成酶多底物少的局面，一方面，蛋白酶之間形成競爭關(guān)系，使酶解程度降低，另一方面未能與酪蛋白結(jié)合的酶會酶解水解產(chǎn)物，使抗菌肽的量減少，從而降低抑菌活性。加酶量為5 000 U/g時(shí)對3種菌的抑菌效果達(dá)到最高，為最適加酶量。

2.2.3 底物質(zhì)量濃度的影響

在酶解溫度為60℃，加酶量5 000 U/g，pH值為5.5的反應(yīng)體系下，酶解山羊乳酪蛋白2.5 h，底物質(zhì)量濃度對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖4所示。

圖4 底物質(zhì)量濃度對山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性的影響

由圖4可以看出，在底物質(zhì)量濃度為40～80 g/L時(shí)，酶解物對3種菌的抑制作用隨底物質(zhì)量濃度的增加而增大，根據(jù)單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)理論，底物質(zhì)量濃度較低時(shí)，酶解液水解程度隨底物質(zhì)量濃度增加而增大，水解產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽濃度增大，酶解液對3種菌抑菌作用也較大；而在底物質(zhì)量濃度大于80 g/L時(shí)，抑菌圈直徑減小，說明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過80 g/L后，體系開始出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。因此，以80 g/L為最適底物質(zhì)量濃度。

2.2.4 pH值的影響

在酶解溫度60℃，酶解時(shí)間2.5 h，加酶量5 000 U/g和底物質(zhì)量濃度為80 g/L的條件下，pH值對酶解物抑菌活性的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著反應(yīng)體系內(nèi)pH值的增大，酶解物對3種菌的抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在反應(yīng)體系中，酶解酪蛋白的水解酶的空間構(gòu)象受pH值的影響較大，在過酸過堿的環(huán)境下，水解酶的空間構(gòu)象會改變使其降低其活性，從而生成的抗菌肽的量也降低。因此，反應(yīng)體系最適合pH值確定為6.0。

圖5 pH值對羊乳酪蛋白酶解液抑菌活性的影響

2.2.5 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最適條件，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對加酶量、底物濃度、酶解時(shí)間和pH值進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)確定酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果分析如表3所示。

表3中，R值最大的為pH值，其次為加酶量，然后是酶解時(shí)間，底物質(zhì)量濃度R值最小?？梢?，實(shí)驗(yàn)中各因素對酶解產(chǎn)物抑菌活性的影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即pH值＞加酶量＞酶解時(shí)間＞底物質(zhì)量濃度。ki值顯示木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即在60℃下，酶解時(shí)間為1.5 h，加酶量為5 000 U/g，底物質(zhì)量濃度8%，pH值為6.0，恰為正交實(shí)驗(yàn)第2組。

表3 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.3 討論

(1)山羊乳酪蛋白的木瓜蛋白酶酶解物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為10.5 mm，10.3 mm和10.5 mm，這與一些牛乳酪蛋白酶解物的抑菌圈相比，直徑比較小，如胡志和等人利用胰蛋白酶解牛乳酪蛋白，獲得抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.5 mm[7]；付莉等人利用中性蛋白酶水解酪蛋白所得抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為21.93 mm[20]。這可能與本試驗(yàn)用于制備的酪蛋白為粗品(酪蛋白濃度為18.78%)，酶解底物純度較小有關(guān)。

(2)熊清權(quán)等人[21]利用木瓜蛋白酶酶解牛乳酪蛋白制備抗菌肽，確定酶解的最佳時(shí)間為4.5 h，而本試驗(yàn)最佳酶解時(shí)間為1.5 h，相差較大，這可能與山羊乳酪蛋白與牛乳酪蛋白自身性質(zhì)有關(guān)，Jainska研究表明，在體外用胰蛋白酶酶解酪蛋白，羊乳酪蛋白有96%被水解，而牛乳酪蛋白只水解了70%～90%[22]；在人的胃液和十二指腸液的作用下，30 min內(nèi)只有23%的羊乳酪蛋白未被水解，而牛乳酪蛋白還有83%未被水解[23]。說明羊乳酪蛋白比牛乳酪蛋白存在更大的溶解性，更易被酶解。

表3木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設(shè)計(jì)與結(jié)果分析。

(3)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果相比，酶解時(shí)間不一致，單因素試驗(yàn)時(shí)最適酶解時(shí)間為2.5 h，而正交試驗(yàn)為1.5 h，這是因?yàn)樵谧鰡我蛩卦囼?yàn)時(shí)，首先考慮了酶解時(shí)間，加酶量、pH值和底物質(zhì)量濃度均為選酶時(shí)設(shè)定的初始條件，也就是說2.5 h是在其他因素為初始條件下得到的較好的結(jié)果，與做正交試驗(yàn)時(shí)各因素的優(yōu)化條件不一樣，優(yōu)化試驗(yàn)證明，酶解1.5 h，酶解物抗菌效果更佳。

3 結(jié) 論

(1)木瓜蛋白酶是山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶，其酶解物對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)。

(2)木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的最佳工藝為加酶量為5 000 U/g，底物質(zhì)量濃度80 g/L，pH值為6.0，在60℃酶解1.5 h，所得酶解液對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌圈直徑均在10.5 mm左右。

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