黃媛媛 馬宏 賈振華 黃亞麗 宋水山 張霞

（1.河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊 050081）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由害蟲造成的損失占農(nóng)作物總損失的15%以上，因此對(duì)害蟲的防治是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要任務(wù)。傳統(tǒng)的害蟲防治主要為化學(xué)防治，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)影響人類健康并對(duì)環(huán)境造成污染。而生物農(nóng)藥以其簡(jiǎn)便有效，對(duì)環(huán)境和生物安全的優(yōu)點(diǎn)，引起了世人的高度重視［1]。目前蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是世界上研究最為深入、應(yīng)用面最廣的殺蟲微生物。但在實(shí)際應(yīng)用中由于長(zhǎng)期使用Bt，使得多種害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生了抗性，其中夜蛾科害蟲粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）對(duì)Bt制劑產(chǎn)生抗性的防治尤為棘手［2]。群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)是指細(xì)菌細(xì)胞根據(jù)密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的生理行為［3]，群體感應(yīng)參與多種生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，如調(diào)控細(xì)菌毒性因子產(chǎn)生、抗生素合成、生物膜形成等［4]，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病性、對(duì)耐非生物脅迫中的作用等［5]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲中腸細(xì)菌也具有群體感應(yīng)現(xiàn)象，2007年，Guan 等［6]鑒定了來(lái)自舞毒蛾幼蟲中腸免培養(yǎng)細(xì)菌的信號(hào)分子合成基因，該研究屬首次從免培養(yǎng)細(xì)菌中鑒定新的群體感應(yīng)誘導(dǎo)子類別。之后，Borlee等［7]研究了菜粉蝶幼蟲中腸土著微生物和致病微生物產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子的情況，該研究證實(shí)在菜粉蝶幼蟲的堿性腸道環(huán)境中細(xì)菌之間的信號(hào)分子AHL是可以進(jìn)行交流的，并且有利于PAO1的致病性。粉紋夜蛾作為昆蟲中腸防御體系研究最為深入的昆蟲，主要集中在中腸圍食膜蛋白結(jié)構(gòu)和Bt殺蟲蛋白受體方面，而對(duì)粉紋夜蛾中腸微生物群體感應(yīng)的研究尚未見系統(tǒng)報(bào)道。

從細(xì)菌群體感應(yīng)現(xiàn)象出發(fā)，探索粉紋夜蛾中腸中產(chǎn)信號(hào)分子的微生物與Bt殺蟲劑的相互作用，是強(qiáng)化Bt的殺蟲作用、增強(qiáng)害蟲生物防治效果的一個(gè)新途徑，具有重要的理論和實(shí)際意義。本研究從粉紋夜蛾中腸中進(jìn)行產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子菌株的篩選，通過形態(tài)觀察，生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定來(lái)確定該菌的種屬，并分析其產(chǎn)生信號(hào)分子的種類。該研究的進(jìn)行對(duì)明確和闡明粉紋夜蛾中腸細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)Bt殺蟲活性的可能作用與分子機(jī)理，有望為提高生物殺蟲劑防效和預(yù)防害蟲對(duì)生物殺蟲劑的抗性提供新的途徑與新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026由本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，粉紋夜蛾幼蟲由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)郭巍教授實(shí)驗(yàn)室提供，信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品（C6-HSL、3O C6-HSL）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 粉紋夜蛾中腸微生物菌株分離 選取健康粉紋夜蛾幼蟲3條，殺死后75 %的酒精中消毒10 s、0.1% 升汞液中消毒2 min，滅菌水沖洗3次，之后在無(wú)菌條件下解剖出中腸組織研磨，采用梯度稀釋法將研磨液稀釋至1×10-6、1×10-7、1×10-8，并吸3個(gè)濃度的稀釋液各100 μL分別涂布于LB平板中，各稀釋度重復(fù)3 次，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌株生長(zhǎng)情況，然后挑取菌落形態(tài)差異明顯的菌落，依次編號(hào)并進(jìn)行多次純化，得到單菌落后LB試管保存?zhèn)溆茫?]。

1.2.2 產(chǎn)AHLs群體感應(yīng)信號(hào)分子菌株的篩選 將過夜培養(yǎng)的報(bào)告菌CV026與50 mL 含有1.5%瓊脂的LB 培養(yǎng)基混合，倒平板。在平板底部畫出十字方格，將保存的從粉紋夜蛾消化道中分離出來(lái)的不同菌株用牙簽點(diǎn)接在每個(gè)方格中，30℃恒溫培養(yǎng)，定時(shí)觀察各個(gè)菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)生色素情況，如果菌株周圍產(chǎn)生紫色則初步確定該菌株為產(chǎn)生信號(hào)分子的菌株。

1.2.3 菌落及菌體形態(tài)觀察 將篩選出來(lái)的產(chǎn)信號(hào)分子的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄LB培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單菌落形態(tài)。挑取單菌落的菌體進(jìn)行Gram染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形狀、染色、產(chǎn)芽孢等情況［9]。

1.2.4 微生物菌株的16S rDNA擴(kuò)增及擴(kuò)增片段的測(cè)序 將產(chǎn)AHLs信號(hào)分子的菌株接種到LB培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，離心獲得菌體后采用天根基因組DNA小提試劑盒提取基因組DNA。以提取的細(xì)菌DNA 作為模板，以16S rDNA通用引物：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和II：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，rTaq 0.2 μL，模板 1 μL，上下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水12.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增正確的PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果輸入到GenBank中，用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較，利用Clustal 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算進(jìn)化距離，采用Mega 5.2 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.6 菌株生理生化反應(yīng)測(cè)定 基于細(xì)菌的16S rDNA分子生物學(xué)方法鑒定的初步結(jié)果，參考伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，進(jìn)行蒙氏腸球菌特異性生理生化反應(yīng)，包括運(yùn)行性測(cè)定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、耐鹽性試驗(yàn)、是否產(chǎn)H2S、不同糖類利用情況、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P試驗(yàn)）、甲基紅試驗(yàn)（M.R試驗(yàn)）、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)測(cè)定等，進(jìn)行細(xì)菌生理生化鑒定［10]。

1.2.7 信號(hào)分子的提取及鑒定 將產(chǎn)AHLs菌株接種到LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，菌液5 000 r/min離心3 min，吸取上清液后加入等體積二氯甲烷進(jìn)行萃取，將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后重溶于1 mL乙腈中，即得到信號(hào)分子樣品。用微量移液器將4 μL樣品點(diǎn)在C18反相薄層板上，用甲醇水（6040，V/V）的展開劑展開，充分展開后蒸發(fā)溶劑，用混有C. violaceum026檢測(cè)菌株的軟瓊脂覆蓋在薄層板上，30℃過夜培養(yǎng)后觀察試驗(yàn)結(jié)果的顯色情況［11]。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子菌株的分離

通過稀釋涂平板的方法從粉紋夜蛾中腸中共分離出細(xì)菌120株，將這些菌株為備用菌株進(jìn)行產(chǎn)信號(hào)分子菌株的篩選。

產(chǎn)AHLs信號(hào)分子菌株的分離采用平板篩選法，用的報(bào)告菌為Chromobacterium violaceumCV026，通過該方法，從120株菌株分離出2株產(chǎn)信號(hào)分子的菌株（圖1），菌株編號(hào)分別為Tni-9和Se-9。

圖1 產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子的菌株篩選結(jié)果

2.2 產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子菌株的鑒定

2.2.1 菌株的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征 將菌株Tni-9和Se-9接種在LB平板上，30℃培養(yǎng)48 h觀察其菌落形態(tài)，Tni-9和Se-9菌落近圓形，邊緣嚙蝕狀，顏色為乳白色，表面光滑無(wú)光澤不透明。將菌株Tni-9和Se-9進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其形態(tài)為圓形或卵圓形，單個(gè)或成對(duì)排列且革蘭氏染色為陽(yáng)性（圖2，圖3）。

圖2 Tni-9顯微鏡下鏡檢照片（100ⅹ）

圖3 Se-9顯微鏡下鏡檢照片（100ⅹ）

2.2.2 菌株Tni-9、Se-9的16S rDNA基因鑒定 擴(kuò)增菌株Tni-9、Se-9的16S rDNA基因得到一條明亮的特異條帶，長(zhǎng)約1 500 bp（圖4）。獲得了Tni-9、Se-9菌株16S rDNA 核酸序列（GenBank登錄號(hào)分別為：KF551916，KF551917）。根據(jù)16S rDNA序列對(duì)Tni-9、Se-9相近物種進(jìn)行聚類分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果（圖5）表明Tni-9、Se-9的16S rDNA序列與蒙氏腸球菌的序列同源性最近，初步鑒定這兩個(gè)菌株屬于蒙氏腸球菌。

圖4 菌株Tni-9、Se-9 16s rDNA-PCR 電泳圖

2.2.3 菌株的生理生化特征鑒定 根據(jù)上述的分子鑒定結(jié)果選取菌株Se-9進(jìn)行菌株的生理生化檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，菌株Se-9可發(fā)酵的碳水化合物種類廣泛，接觸酶陰性，在6.5% NaCl中可以生長(zhǎng)，V-P反應(yīng)陽(yáng)性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定菌株Se-9為蒙氏腸球菌。

圖5 Tni-9和Se-9的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

表1 Se-9主要生理生化特性

2.3 菌株Se-9產(chǎn)信號(hào)分子種類的確定

以3OC6-HSL和C6-HSL標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照進(jìn)行薄層層析，分析Se-9菌株產(chǎn)生信號(hào)分子的種類，由圖6可以看出兩個(gè)菌株在3OC6-HSL和C6-HSL標(biāo)準(zhǔn)樣品所在的相應(yīng)位置都出現(xiàn)了一個(gè)紫色斑點(diǎn)，說(shuō)明該菌株產(chǎn)生3OC6-HSL和C6-HSL兩種信號(hào)分子。

3 討論

圖6 菌株產(chǎn)信號(hào)分子種類的薄層層析分析

昆蟲腸道棲息著大量的微生物。隨著近年來(lái)研究腸道微生物的方法不斷進(jìn)步，尤其是基于16S rDNA的分子生物學(xué)方法的應(yīng)用，人們對(duì)腸道微生物的了解逐漸加深。腸道微生物對(duì)昆蟲寄主的作用包括提供營(yíng)養(yǎng)、利用拓殖抗性抵抗外來(lái)微生物侵襲、參與多重營(yíng)養(yǎng)關(guān)系、引起昆蟲免疫反應(yīng)等。粉紋夜蛾是昆蟲中腸防御體系研究最為深入的昆蟲，但主要集中在中腸圍食膜蛋白結(jié)構(gòu)和Bt殺蟲蛋白受體方面，對(duì)農(nóng)業(yè)上重要害蟲粉紋夜蛾中腸微生物群體感應(yīng)的研究尚未見系統(tǒng)報(bào)道。本研究從粉紋夜蛾中腸中分離出120個(gè)菌株，再利用luxI/luxRQS 系統(tǒng)的微生物傳感菌紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026分離出兩株可以產(chǎn)信號(hào)分子的菌株Tni-9和Se-9。對(duì)這兩個(gè)菌株進(jìn)行了生理生化分析，通過16S rDNA擴(kuò)增得到一條大小為1 500 bp左右的條帶。在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)菌株與蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtiiATCC 43186）的16S rDNA核酸序列同源性最高達(dá)到99%。將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank 中的相關(guān)屬種的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，以大腸桿菌為外群，用Mega5.2 軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹。100次比對(duì)中98次都與蒙氏腸球菌聚合到同一個(gè)分支，鑒定這兩個(gè)菌株屬于蒙氏腸球菌。提取菌株Se-9所產(chǎn)生的信號(hào)分子，通過薄層層析與微生物傳感菌相結(jié)合的方法對(duì)菌株產(chǎn)生的信號(hào)分子進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示Se-9可以產(chǎn)生兩種信號(hào)分子C6-HSL和3OC6-HSL。該菌株的獲得，為下一步利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)構(gòu)建群體感應(yīng)缺失突變體，并在缺少及富含該產(chǎn)信號(hào)分子菌株條件下測(cè)定昆蟲的殺蟲活性奠定基礎(chǔ)（本試驗(yàn)正在進(jìn)行中）。整個(gè)研究的目的是以粉紋夜蛾為研究對(duì)象，將細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)和昆蟲中腸防御體系聯(lián)系起來(lái)，探索群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)微生物殺蟲活性影響，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中昆蟲生物防治提供理論依據(jù)和新的思路。

4 結(jié)論

從粉紋夜蛾中腸中分離出120個(gè)菌株，采用群體感應(yīng)報(bào)告菌株CV026進(jìn)行復(fù)篩，分離出兩株可以產(chǎn)信號(hào)分子的菌株Tni-9和Se-9。對(duì)這兩株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析、16S rDNA 鑒定及生理生化分析，鑒定這兩株菌為蒙氏腸球菌。提取Se-9的信號(hào)分子，通過薄層層析分析顯示Se-9可以產(chǎn)生兩種信號(hào)分子C6-HSL和3OC6-HSL。

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