鐘開新 陳麗芝 李陽源

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，珠海 519060）

分泌蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后開始一系列分泌過程。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，分泌蛋白進行折疊，隨后完成糖基化、磷酸化和二硫鍵形成等翻譯后修飾過程，才能被轉(zhuǎn)運到細胞外。只有正確折疊的分泌蛋白才能被轉(zhuǎn)運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而未折疊或折疊錯誤的分泌蛋白留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。在酵母過表達體系中，如果蛋白折疊機制飽和或蛋白折疊錯誤，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)不斷積累未折疊或折疊錯誤的分泌蛋白，從而引發(fā)細胞內(nèi)UPR（The unfolded protein response）反應(yīng)［1]。最新研究表明，UPR反應(yīng)是酵母細胞中由錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白脅迫引發(fā)的信號調(diào)控途徑，與一系列UPR目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，如分子伴侶、折疊酶及參與糖基化、脂類代謝的蛋白酶等。轉(zhuǎn)錄因子Hac1p在激活、維持UPR反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，通過依賴于UPR信號響應(yīng)元件（UPRE）調(diào)節(jié)蛋白折疊或降解等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白引發(fā)的信號脅迫。

利用共表達HAC1蛋白提高外源蛋白在酵母中表達量的報道甚少。Guerfal等［2]將AOX1啟動子調(diào)控的hac1p基因分別與小鼠白介素-10基因（mIL-10）、反式唾液酸酶基因（TS）在酵母中共表達，提高了mIL-10、TS蛋白表達量；而由GAP啟動子調(diào)控的hac1基因?qū)Φ鞍妆磉_量無影響［3，4]。這一研究結(jié)果表明過表達HAC1可提高酵母表達系統(tǒng)中外源蛋白的表達含量。本研究將來源于畢氏酵母GS115的hac1基因構(gòu)建到pPIC9K表達載體中，經(jīng)線性化后電擊轉(zhuǎn)入Gal-21#感受態(tài)（α-半乳糖苷酶表達菌株pPiczαA-Gal-X33）中，以期過表達HAC1提高酵母表達系統(tǒng)中α-半乳糖苷酶表達量。通過50 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵對比，進一步驗證共表達HAC1蛋白的畢氏酵母產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 克隆受體菌Escherichia coliTOP10，重組酵母菌株GAL-21#（以畢氏酵母X33為受體菌，在基因組內(nèi)已整合有α-半乳糖苷酶基因），酵母GS115為本試驗室保存。質(zhì)粒pPICZαA、pPIC9K購自Invitrogen公司。

1.1.2 工具酶及試劑PfuDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4連接酶均購自上海生工公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；抗生素G418購自Invitrogen公司；對硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1hac1基因的克隆 根據(jù)NCBI發(fā)布的hac1基因序列（XM_002489994.1），設(shè)計引物hac1F：5'-cg catgcccgtagattcttctc-3'和hac1R：5'-actattcctggaagaatacaaagtc-3'。以畢氏酵母GS115基因組DNA為模板，用高保真PfuDNA聚合酶進行PCR擴增，得到hac1基因序列。

1.2.2hac1基因的畢氏酵母表達質(zhì)粒構(gòu)建 將hac1基因PCR擴增產(chǎn)物進行BamH I和NotI雙酶切后，與經(jīng)BamHI和NotI雙酶切的pPIC9K混合，用T4DNA連接酶在4℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后，通過原位菌落PCR驗證及雙酶切鑒定獲得pPIC9K-hac1重組子。

1.2.3 重組表達質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化 構(gòu)建好的pPIC9K-hac1表達載體經(jīng)SacI線性后純化并回收，取適量回收物進行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后的酵母細胞30℃預(yù)培養(yǎng)3 h，然后涂布于含50 μg/mL G418的YPD平板，30℃培養(yǎng)48-72 h，至菌落出現(xiàn)。

1.2.4 共表達HAC1重組畢氏酵母的鑒定 提取重組畢氏酵母基因組DNA，以Invitrogen公司提供的5'AOX1引物（5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和3'AOX1引物（5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min，16℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的α-半乳糖苷酶活性篩選 挑取40個轉(zhuǎn)化子分別培養(yǎng)于裝有5 mL BMGY培養(yǎng)液的50 mL離心管中，置于30℃、250 r/min的搖床中培養(yǎng)1 d后，每24 h加入終濃度0.6%的甲醇進行誘導(dǎo)。2 d后測定各轉(zhuǎn)化子酶活進行初篩。從初篩結(jié)果中挑選出2個具有較高表達酶活的菌株，分別培養(yǎng)于5 mL BMGY培養(yǎng)液的50 mL離心管中，30℃搖床培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)接至裝有50 mL BMGY培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，且調(diào)整初始細胞濃度OD600均約為1。30℃、250 r/min的搖床中培養(yǎng)1 d后，每24 h加入終濃度0.6%的甲醇進行誘導(dǎo)。每24 h測定一次總蛋白濃度及α-半乳糖苷酶活性。

1.2.6 總蛋白濃度及α-半乳糖苷酶活性測定 總蛋白濃度測定方法：取適量培養(yǎng)液離心后獲得的上清液進行稀釋，按改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒法進行測定。

α-半乳糖苷酶活性測定方法［5，6]：酶活單位定義：在pH5.5且37℃條件下，10 min內(nèi)從10 mmol/L對硝基酚-α-D-吡喃半乳糖中降解釋放1 μmol對硝基酚所需要的酶量為一個酶活單位U。經(jīng)濃度為0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH5.5）稀釋的酶液和底物對硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液于37℃下振蕩10 min預(yù)熱，然后吸取各溶液0.1 mL，充分混合，于37℃恒溫振蕩10 min，加入0.8 mL 濃度為0.2 mol/L的碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，在400 nm處測定吸光度?？瞻讓φ沼媒?jīng)過預(yù)熱的酶液各0.1 mL，然后加入0.8 mL碳酸鈉溶液，振蕩混勻，再加入0.1 mL預(yù)熱的底物于37℃振蕩10 min。

1.2.7 50 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵對比 將Gal-21#與Gal-HAC1-4#工程菌進行50 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，對比其產(chǎn)酶能力。50 L發(fā)酵罐中的工程菌誘導(dǎo)過程分為甘油單批培養(yǎng)，甘油分批補料培養(yǎng)和甲醇分批補料培養(yǎng)3個不同階段。首先，將工程菌種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有20 L甘油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于pH為5.5、溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min的初始條件下培養(yǎng)約18 h，此過程通過調(diào)節(jié)罐內(nèi)氣壓將溶氧控制在30%左右。當甘油耗盡時開始分批流加甘油補料培養(yǎng)基，如此反復(fù)進行幾次，當培養(yǎng)基濕重高于150 mg/mL時開始流加甲醇補料培養(yǎng)基以誘導(dǎo)產(chǎn)酶。誘導(dǎo)前期根據(jù)DO曲線的變化采取梯度流加，控制甲醇終濃度分別為2%、3%、5%、8%和12%，如此培養(yǎng)12-15 h后進入誘導(dǎo)穩(wěn)定期，此后以10 g/h的速率恒速流加甲醇補料培養(yǎng)基，并每隔24 h取樣進行酶活及蛋白含量分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增hac1基因

以酵母GS115基因組DNA為模板，利用高保真性Pfu酶擴增hac1基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在1.2 kb處可見一條特異性條帶，與預(yù)期的目的條帶大小相同，見圖1。

圖1 hac1基因擴增產(chǎn)物鑒定

2.2 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒

hac1基因經(jīng)酶切后連接到pPC9K載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)LBA（含Amp+）抗性平板篩選獲得轉(zhuǎn)化子。原位菌落PCR產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約1.2 kb的特異性DNA條帶，見圖2，圖3，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。其測序結(jié)果與GenBank中錄入的基因序列一致。

圖2 原位菌落PCR產(chǎn)物鑒定

圖3 重組表達載體pPIC9K-Hac1雙酶切鑒定

2.3 重組酵母的獲得與篩選

重組載體pPIC9K-hac1經(jīng)線性化后，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)工程菌GAL-21#，通過加有G418的YPD固體平板進行篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子。重組轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到5 mL BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)48 h，測定培養(yǎng)基上清液中α-半乳糖苷酶的活性。在近40個轉(zhuǎn)化子中，篩選得到GAL-HAC1-4#（126.95 U/mL）、GAL-HAC1-21#（66.66 U/mL），其表達α-半乳糖苷酶活性分別是GAL-21#（26.43 U/mL）的4.8、2.5倍。

2.4 HAC1共表達對重組酵母α-半乳糖苷酶表達的影響

250 mL搖瓶培養(yǎng)重組酵母GAL-21#、GALHAC1-4#、GAL-HAC1-21#菌種，每24 h加甲醇誘導(dǎo)表達α-半乳糖苷酶，測定上清液中總蛋白含量及α-半乳糖苷酶活性。在培養(yǎng)液中細胞濃度幾乎相同的情況下，GAL-HAC1-4#發(fā)酵培養(yǎng)液中總蛋白含量明顯高于GAL-21#發(fā)酵液（圖4），甲醇誘導(dǎo)96 h時GAL-HAC1-4#發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶活性是GAL-21#發(fā)酵液的2.2倍（圖5）。表明HAC1共表達顯著增加了酵母表達系統(tǒng)中外源蛋白α-半乳糖苷酶的分泌量，大大提高了發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶的酶活。

圖4 共表達菌株與原始菌株發(fā)酵表達總蛋白含量

圖5 共表達菌株與原始菌株發(fā)酵表達α-半乳糖苷酶酶活

2.5 共表達HAC1重組畢氏酵母鑒定

提取重組畢氏酵母GAL-21#、GAL-HAC1-4#、GAL-HAC1-21#基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。GALHAC1-4#、GAL-HAC1-21#可見約1.4 kb（包含載體片段200 bp，hac1基因片段約1.2 kb）、2.4 kb（包含載體片段約200 bp，gal基因片段約2.2 kb）及2.8 kb（酵母基因組AOX1基因）的DNA片段，而GAL-21#只可見2.4 kb和2.8 kb的D NA片段，見圖6。表明重組表達質(zhì)粒pPIC9K-hac1已重組至GAL-21#酵母基因組中。

2.6 50 L發(fā)酵罐進行工程菌發(fā)酵

圖6 共表達HAC1重組畢氏酵母的PCR產(chǎn)物鑒定

Gal-21#與Gal-HAC1-4#工程菌在50 L發(fā)酵罐中分別經(jīng)過甘油單批培養(yǎng)，甘油分批補料培養(yǎng)和甲醇分批補料培養(yǎng)3個不同階段，其最終發(fā)酵酶活分別為5 200 U/mL和6 560 U/mL（圖7）。相比Gal-21#，Gal-HAC1-4#工程菌最終發(fā)酵酶活提高了27%。加入甲醇誘導(dǎo)后，Gal-HAC-4#工程菌發(fā)酵液中粗蛋白含量均高于Gal-21#工程菌（圖8）。這些結(jié)果進一步表明，畢氏酵母產(chǎn)α-半乳糖苷酶工程菌中共表達HAC1蛋白，可以大大提高工程菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶的產(chǎn)酶能力，提高了目的蛋白的表達量，且可運用于大工業(yè)化生產(chǎn)中。

圖7 50 L發(fā)酵罐中Gal-21#和Gal-HAC1-4#發(fā)酵酶活對比

圖8 50 L發(fā)酵罐中Gal-21#和Gal-HAC1-4# 發(fā)酵液中蛋白含量對比

3 討論

酵母表達系統(tǒng)中外源蛋白分泌是一個極其復(fù)雜連續(xù)的過程，影響其表達量的因素眾多，包括重組載體啟動子的強弱，基因密碼子的優(yōu)化，基因拷貝數(shù)，mRNA轉(zhuǎn)錄過程，非成熟肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運過程，蛋白的翻譯后修飾過程等［7]。

在真核細胞中，大部分分泌蛋白和跨膜蛋白以非折疊肽的形式轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，且在其腔內(nèi)進行一系列的折疊和加工過程，從而形成成熟蛋白，并被主動運送到細胞外，這就形成了一種蛋白成熟過程的動態(tài)平衡［8]。如果蛋白折疊過程受到限制，導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中過量積累，從而打破這一平衡，細胞就會激發(fā)胞內(nèi)UPR效應(yīng)［9]。UPR效應(yīng)激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HAC1mRNA在細胞核中進行非常規(guī)剪接反應(yīng)，翻譯形成Hac1p，Hac1p激活相關(guān)伴侶蛋白、折疊因子等基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，進一步提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的折疊過程，促進蛋白成熟過程的動態(tài)平衡［10]。如果這一穩(wěn)態(tài)未能重新形成，過度積累的未折疊蛋白加速細胞死亡，從而導(dǎo)致表達蛋白分泌量下降或酶活降低［11]。

Guerfal等［2]將由AOX1啟動子調(diào)控表達的HAC1p分別與小鼠白介素-10（mIL-10）和來源于克氏錐蟲的反式唾液酸酶（TS）在酵母表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達。研究結(jié)果表明，HAC1p的過表達提高了mIL-10蛋白表達量2.2倍，提高了TS蛋白表達量2.1倍。本研究將由AOX1啟動子調(diào)控表達的HAC1與相同啟動子調(diào)控表達的α-半乳糖苷酶在酵母表達系統(tǒng)中共表達，研究結(jié)果表明，HAC1的過表達提高了酵母表達系統(tǒng)中總蛋白的含量，甲醇誘導(dǎo)96 h時其α-半乳糖苷酶活性最大提高了2.2倍。通過在50 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵研究，表明Gal-HAC1-4#工程菌在168 h時的最終發(fā)酵酶活比Gal-21#工程菌提高了27%，自加入甲醇誘導(dǎo)后，Gal-HAC1-4#工程菌發(fā)酵液中粗蛋白濃度均高于Gal-21#。這些研究結(jié)果說明，在酵母表達系統(tǒng)中，可能存在大量非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，而利用過表達HAC1可將這些非折疊蛋白或錯誤折疊蛋白重新折疊成成熟蛋白的功能，可以大大提高目的蛋白的表達量。

作者嘗試將過表達HAC1蛋白分別與木聚糖酶、纖維素酶、植酸酶等在酵母系統(tǒng)中共表達，木聚糖酶、纖維素酶和植酸酶蛋白表達量均無顯著提高，表明過表達HAC1影響分泌蛋白的蛋白表達可能具有一定的選擇調(diào)控機制，這一機制有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

將hac1基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)α-半乳糖苷酶的重組酵母菌株Gal-21#中，在5 mL培養(yǎng)基中誘導(dǎo)48 h篩選獲得產(chǎn)α-半乳糖苷酶高表達菌株：GAL-HAC1-4#、GALHAC1-21#，其表達α-半乳糖苷酶活性分別是原始菌株GAL-21#的4.8、2.5倍。在50 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵進一步對比Gal-21#菌株和Gal-HAC1-4#菌株的產(chǎn)酶能力，Gal-HAC1-4#菌株最終發(fā)酵酶活比Gal-21#菌株提高了27%，Gal-HAC1-4#菌株發(fā)酵液中粗蛋白濃度也均高于Gal-21#菌株。表明共表達HAC1蛋白提高了畢氏酵母異源表達α-半乳糖苷酶的能力，且可運用于大工業(yè)生產(chǎn)中。

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