李雪 胡秀彩 蘭云 沈曉靜 呂愛軍 朱愛華

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221 116）

嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）是一種典型的魚、畜、人共患病病原菌［1，2]，主要致病因子包括外毒素、胞外蛋白酶等，并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AhyR基因有關(guān)［3]。研究表明，嗜水氣單胞菌AhyR基因調(diào)控溶血素、胞外蛋白酶等產(chǎn)生［4，5]。畢志香等［4，6]構(gòu)建嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因突變株J-1△AhyR，發(fā)現(xiàn)AhyR基因與蛋白酶、溶血素、DNA酶等主要致病因子表達(dá)有關(guān)。嗜水氣單胞菌AhyR基因突變阻止產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯，從而進(jìn)一步抑制蛋白酶的產(chǎn)生［5]。Swift等［7]報(bào)道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白能夠促使胞外蛋白酶較早表達(dá)，有效防御病原菌侵入抵制感染。此外，AhyR蛋白與細(xì)菌群體感應(yīng)信號調(diào)控蛋白LuxR功能類似，參與調(diào)控生物膜形成以及胞外蛋白酶產(chǎn)生［8，9]。關(guān)于魚源嗜水氣單胞菌AhyR基因的序列分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本 研究從嗜水氣單胞菌Zf1菌株中克隆獲得AhyR基因，并對其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有助于理解嗜水氣單胞菌的分子致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌Zf1菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考嗜水氣單胞菌AhyR基因序列（登錄號：YP_855090），設(shè)計(jì)特異性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR擴(kuò)增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Zf1菌株AhyR基因克隆 參考李雪等［10]方法，將Zf1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液用于提取基因組DNA，具體操作參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書。將提取到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增采用10 μL體系：提取的Zf1菌株基因組DNA模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Master Mix 5.0 μL，ddH2O 3 μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸2 min，經(jīng)30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。得到目的條帶后，按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將膠回收得到的DNA片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。將AhyR基因膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆菌樣送上海生工測序。

1.2.3 基因序列及其結(jié)構(gòu)分析 用Edit seq推測氨基酸序列，利用Motif Scan、blastp程序預(yù)測結(jié)構(gòu)域，NetPhos 2.0 Server預(yù)測磷酸化位點(diǎn)［11]。通過鄰接法（Neighbor-Joining），應(yīng)用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析。將蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，用RasMolVersion 2.7.5.2查看蛋白三級結(jié)構(gòu)，并用拉馬錢德蘭圖（Ramachandran plot）檢測蛋白模型的合理性。

2 結(jié)果

2.1 Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析

PCR擴(kuò)增得到一條特異性條帶（圖1），測序獲得AhyR基因大小為1 063 bp，引物序列見圖2，推測ORF編碼260 aa；查找結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)AhyR蛋白18-168 aa區(qū)域?yàn)樽泽w誘導(dǎo)物結(jié)合域（PF03472），176-241 aa區(qū)域?yàn)長uxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PS50043），183-227 aa區(qū)域?yàn)镈NA結(jié)合域（PF04967）（圖3）；預(yù)測AhyR蛋白含有13個磷酸化位點(diǎn)，其中有8個絲氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3個蘇氨酸（30T、184T、188T、）和2個酪氨酸（161Y、231Y），進(jìn)一步預(yù)測酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（173S、184T、210T、222T）（圖4）。

圖1 AhyR基因的PCR電泳

2.2 AhyR基因蛋白序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對AhyR蛋白進(jìn)行多重序列比對表明氣單胞屬不同菌種AhyR氨基酸序列高度保守，與殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）、維隆氣單胞菌（A. veronii）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）、中間氣單胞菌（A. media）、簡達(dá)氣單胞菌（A. jandaei）序列同源性分別為100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白與嗜水氣單胞菌（登錄號YP_855090）的AhyR蛋白親緣性最近，自然聚為一支（圖5）。

2.3 AhyR基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 Zf1菌株AhyR基因的上下游引物測序圖譜

圖3 AhyR蛋白blastp保守結(jié)構(gòu)域圖

圖4 AhyR蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

進(jìn)一步分析AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)，確定以群體感應(yīng)控制阻遏物的A鏈（PDB：3SZT_A）為模板，該蛋白與模板相似性達(dá)28.40%，通過SWISSMODEL在線比較建模結(jié)果，如圖6-A所示，AhyR蛋白主要由15個α螺旋、5個β折疊和19個轉(zhuǎn)角構(gòu)成，該三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)序列特征分析結(jié)果基本一致；圖6-B顯示LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域主要以α螺旋分布在三級結(jié)構(gòu)C端外側(cè)。拉馬錢德蘭圖檢測結(jié)果（圖7）表明有93.9%氨基酸序列位于最適宜區(qū)，5.9%氨基酸序列位于允許區(qū)，證實(shí)AhyR基因推導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型合理。

3 討論

圖5 鄰接法構(gòu)建AhyR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 AhyR蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

嗜水氣單胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，還與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AhyR基因有關(guān)［3]。AhyR蛋白在嗜水氣單胞菌蛋白酶活性調(diào)節(jié)中起重要作用，促使胞外蛋白酶較早表達(dá)，有效防御病原菌侵入抵制感染［7]。Bi等［4]利用自殺性重組質(zhì)粒pJP-AhyR插入誘變嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因，構(gòu)建該基因突變株J-1△AhyR，證實(shí)AhyR基因與嗜水氣單胞菌致病因子表達(dá)有關(guān)。Kirke等［8]報(bào)道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白屬于LuxR型家族調(diào)控蛋白之一，AhyR基因能夠調(diào)節(jié)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶生成，與生物膜形成和細(xì)胞外蛋白酶產(chǎn)生有關(guān)。LuxR調(diào)控蛋白在革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中與自體誘導(dǎo)物（Autoinducers，AI）信號傳遞分子結(jié)合［12]，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)菌多種生理活動［4-9]。此外，細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白PhoB、TraR與LuxR蛋白DNA結(jié)合域高度保守［13，14]。Shindoh等［13]認(rèn)為大腸桿菌PhoB轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白DNA結(jié)合域與磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)激活基因調(diào)控有關(guān)。Vannini等［14]研究發(fā)現(xiàn)根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）TraR蛋白基因結(jié)合區(qū)位于DNA結(jié)合域和GAF/PAS結(jié)構(gòu)域之間。AhyR蛋白N端自體誘導(dǎo)物結(jié)合域?yàn)樾盘柗肿咏Y(jié)合區(qū)域，C端DNA結(jié)合域能與目的基因特異性結(jié)合，以調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性［14，15]。本研究采用PCR方法擴(kuò)增得到嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因序列，預(yù)測含有自體誘導(dǎo)物結(jié)合域和LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道［13，14]一致。此外還發(fā)現(xiàn)，以上兩個功能域?yàn)長uxR型家族調(diào)控蛋白獨(dú)有結(jié)構(gòu)域，有待于進(jìn)行AhyR基因功能的生物學(xué)驗(yàn)證。

圖7 AhyR蛋白片段3D模型的拉馬錢德蘭圖分析

細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（如UhpA、AhyR、LuxR等）磷酸化參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡等生理病理過程，在感染致病過程中起重要調(diào)控作用［16-20]。因此，預(yù)測嗜水氣單胞菌AhyR蛋白的磷酸化位點(diǎn)有助于研究AhyR蛋白功能。Dahl等［18]研究大腸桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白UhpA磷酸化后，能夠結(jié)合到糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT啟動子，實(shí)現(xiàn)UhpT蛋白表達(dá)。Ottosen等［19]鑒定單純皰疹病毒VP16轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白5個磷酸化位點(diǎn)（18S、353S、375S、411S、452S），其中375S在VP16與Oct-1相互作用過程中發(fā)揮重要作用，這可能與病毒介導(dǎo)早期基因啟動及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關(guān)。Jeli?i?等［20]誘導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（Gal4）DNA結(jié)合域中7個絲氨酸位點(diǎn)突變，預(yù)測轉(zhuǎn)錄活性和與DNA結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)2個磷酸化位點(diǎn)（22S、85S），認(rèn)為DNA結(jié)合域中的絲氨酸介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄機(jī)制中蛋白質(zhì)相互作用，從而穩(wěn)定激活子Gal4蛋白。本研究預(yù)測Zf1菌株AhyR蛋白含有13個磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，173S、184T為酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。此外，對氣單胞屬AhyR蛋白序列比對，結(jié)果表明氨基酸序列同源性高于90%，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白，這與鄭世超等［21]報(bào)道結(jié)果基本一致。進(jìn)一步分析AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)，以及拉馬錢德蘭圖檢測表明AhyR基因推導(dǎo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型合理，有助于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證AhyR蛋白功能及其分子調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

獲得嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因大小為1 063 bp，推導(dǎo)編碼260 aa，發(fā)現(xiàn)含有自體誘導(dǎo)物結(jié)合域（PF03472）、LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PS50043）及13個磷酸化位點(diǎn)。AhyR蛋白三級結(jié)構(gòu)顯示LuxR型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域主要以α螺旋分布在C端外側(cè)，與拉馬錢德蘭圖檢測分析AhyR蛋白空間結(jié)構(gòu)基本一致。

［1] Yadav AS, Kumar A. Prevalence of enterotoxigenic motile aeromonads in children, fish, milk and ice-cream and their public health significance［J] . The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 2000, 31（1）：153-156.

［2] 蔡麗娟, 徐寶青, 林啟存. 水產(chǎn)致病性嗜水氣單胞菌耐藥性比較與分析［J] . 水產(chǎn)科學(xué), 2011, 1（30）：42-45.

［3] 邱軍強(qiáng), 楊先樂, 等. 嗜水氣單胞菌毒力因子特性及作用機(jī)理研究進(jìn)展［J] . 中國病原生物學(xué)雜志, 2009, 4（8）：616-619.

［4] Bi ZX, Liu YJ, Lu CP. Contribution of AhyR to virulence ofAeromonas hydrophilaJ-1［J] . Research in Veterinary Science,2007, 83（2）：150-156.

［5] Swift S, Karlyshev AV, Fish L, et al. Quorum sensing inAeromonas hydrophilaandAeromonas almonicida：Identification of theLuxRIHomologsAhyRIand their cognate N-Acylhomoserine lactone signal［J] . Journal of Bacteriology, 1997, 179（17）：5271-5281.

［6] 畢志香, 劉永杰. 嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因（ahyR）突變株的構(gòu)建及特性分析［J] . 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 14（1）：55-59.

［7] Swift S, Lynch MJ, Fish L, et al. Quorum sensing-dependent regulation and blockade of exoprotease production inAeromonas hydrophila［J] . Infection and Immunity, 1999, 67（10）：5192-5199.

［8] Kirke DF, Swift S, et al. TheAeromonas hydrophilaLuxR homologue AhyR regulates the N-acyl homoserine lactone synthase, AhyI positively and negatively in a growth phase-dependent manner［J] .FEMS Microbiology Letters, 2004, 241（1）：109-117.

［9] Lynch MJ, Swift S, Kirke DF, et al. The regulation of biofilm development by quorum sensing inAeromonas hydrophila［J] . Environmental Microbiology, 2002, 4（1）：18-28.

［10] 李雪, 王藝, 蘭云, 等. 嗜水氣單胞菌氣溶素基因克隆與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測［J] . 生物技術(shù), 2013, 23（2）：4-9.

［11] 張林華, 邱紅林, 劉超, 等. 天山雪蓮PsaH基因的克隆及序列分析［J] . 生物技術(shù)通報(bào), 2013（6）：75-79．

［12] Nasser W, Reverchon S. New insights into the regulatory mechanisms of the LuxR family of quorum sensing regulators［J] .Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 387（2）：381-390.

［13] Shindoh K, Maenaka K, Akiba T, et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies on the DNA-binding domain of the transcriptional activator protein PhoB fromEscherichia coli［J] .Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography,2002, 58（Pt 10 Pt 2）：1862-1864.

［14] Vannini A, Volpari C, Gargioli C, et al. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA［J] . EMBO Journal, 2002, 21（17）：4393-4401.

［15] Egland KA, Greenberg EP. Quorum sensing inVibrio fischeri：elements of the luxl promoter［J] . Molecular Microbiology, 1999,31（4）：1197-1204.

［16] González JE, Keshavan ND. Messing with bacterial quorum sensing［J] . Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006,70（4）：859-875.

［17] Correa NE, Lauriano CM, McGee R, et al. Phosphorylation of the flagellar regulatory protein FlrC is necessary forVibrio choleraemotility and enhanced colonization［J] . Molecular Microbiology,2000, 35（4）：743-755.

［18] Dahl JL, Wei BY, Kadner RJ. Protein phosphorylation affects binding of theEscherichia colitranscription activator UhpA to the uhpT promoter［J] . Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（3）：1910-1919.

［19] Ottosen S, Herrera FJ, Doroghazi JR, et al. Phosphorylation of the VP16 transcriptional activator protein during herpes simplex virus infection and mutational analysis of putative phosphorylation sites［J] . Virology, 2006, 345（2）：468-481.

［20] Jeli?i? B, Nemet J, Traven A, et al. Solvent exposed serines in the Gal4 DNA binding domain are required for promoter occupancy and transcriptional activationin vivo［J] . FEMS Yeast Research,2013, 14（2）：1567-1356.

［21] 鄭世超, 羅瑛, 魯濤. LuxR 家族調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)及功能［J] .生命科學(xué), 2010, 22（9）：886-895.