陳弘磊 姜 凱 浙江省立同德醫(yī)院檢驗科 杭州 310012

刀豆素A誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞自噬性死亡及其機(jī)制

陳弘磊 姜 凱 浙江省立同德醫(yī)院檢驗科 杭州 310012

目的探討刀豆素A對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的殺傷作用及其機(jī)制。方法采用MTT法檢測不同濃度ConA（concanavalin A）處理MCF-7細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞的增殖情況，并檢測自噬標(biāo)記蛋白LC-3Ⅱ，加入自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）后再檢測MCF-7細(xì)胞對ConA的敏感性。利用基因沉默技術(shù)，抑制BNIP3的表達(dá)，再檢測ConA處理后MCF-7細(xì)胞的增殖和自體吞噬。結(jié)果ConA可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖（P＜0.01），并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬性死亡。ConA處理后MCF-7細(xì)胞的BNIP3顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），利用小RNA抑制BNIP3的表達(dá)后，ConA對MCF-7的增殖抑制作用降低（P＜0.01），并抑制了ConA誘導(dǎo)的自體吞噬效應(yīng)。結(jié)論刀豆素A通過上調(diào)BNIP3的表達(dá)誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

刀豆素A；MCF-7；自體吞噬；BNIP3

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌。手術(shù)、化療、放療等手段雖然可以使患者獲得較高的生存率，但長期化療副反應(yīng)多，且易產(chǎn)生耐藥性。刀豆素A（concanavalin A，Con A）是從刀豆（Jack bean）中提取出來的凝集素。它是四聚體球蛋白，分子量102，000。每個亞基含237個氨基酸殘基，分子量25，500，結(jié)合一個Ca2+和一個Mn2+，含一個糖結(jié)合部位。能與α-甘露糖、α-葡萄糖（細(xì)胞膜糖蛋白上）專一地結(jié)合[1]。它是一種經(jīng)典的T細(xì)胞絲裂原，能激活淋巴細(xì)胞并浸潤至腫瘤組織，殺死腫瘤細(xì)胞，且能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[2-3]。自噬性死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的不同于凋亡的Ⅱ型程序性死亡，以出現(xiàn)過量的自噬小體為主要特征，當(dāng)自噬形成時，胞漿型LC3（LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II的蛋白表達(dá)量可估計自噬水平的高低。自體吞噬可以被3-甲基腺嘌呤所抑制[4]。Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（Bcl-2/adenocar-cinoma E1B19KD interacting protein 3，BNIP3）是包含單BH3區(qū)的促凋亡成員，屬于BH3-only亞家族，研究表明BNIP3在細(xì)胞死亡的傳導(dǎo)途徑中有十分重要的作用，當(dāng)BNIP3表達(dá)顯著增加時，細(xì)胞將發(fā)生過度的自體吞噬并進(jìn)入自噬性死亡[5-6]。本實(shí)驗研究刀豆素A對人乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7的殺傷作用，并探討其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制是否通過表達(dá)BNIP3，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7來自于ATCC，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基。

1.2實(shí)驗試劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司；刀豆素A（concanavalin A，ConA）、噻唑藍(lán)（MTT）、3-甲基腺嘌呤、LC3-Ⅱ多克隆抗體購于美國Sigma公司；細(xì)胞裂解液、β-actin單抗和BNIP3多克隆抗體購自美國Cell signal公司；PVDF膜購于Millipore（USA）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；BNIP3 siRNA及無關(guān)對照siRNA定制于上海吉瑪公司；BNIP3的siRNA序列為：正向：5’-CACGAGCGUCAUGAAGAAAUU-3’，反向：5’-UUUCUUCAUGACGCUCGUGUU-3’。

1.3MTT法檢測ConA對MCF-7細(xì)胞抑制作用 將MCF-7細(xì)胞按 1×104/孔接種于 96孔板， 加入200μL含10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)，設(shè)置3個復(fù)孔，并分別加入0（用磷酸緩沖液PBS代替）、10、20、40μg/mL的ConA培養(yǎng)24h。另設(shè)一組加入3mM的3-MA培養(yǎng)1h，然后再加入40μg/mL的ConA培養(yǎng)24h。24h后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞生長的抑制率以以下公式計算：抑制率=（ODPBS-ODConA）/ODPBS×100%。

1.4Western blot檢測不同濃度ConA對MCF-7細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入0（用PBS代替）、10、20、40μg/mL的ConA培養(yǎng)24h，同時另設(shè)一組在培養(yǎng)瓶中先加入3mM的3-MA培養(yǎng)1h，然后再加入40μg/mL的ConA培養(yǎng)24h，然后取細(xì)胞裂解后做western blot檢測LC3-II和BNIP3的表達(dá)，目標(biāo)蛋白表達(dá)量由它們在膠片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin的灰度比表示。

1.5BNIP3 siRNA基因沉默檢測ConA對MCF-7細(xì)胞的影響 按照Lipofectamine 2000操作說明書在MCF-7培養(yǎng)體系中分別加入100nM的BNIP3 siRNA以及無關(guān)對照siRNA培養(yǎng)16h，之后加40μg/ mL ConA再培養(yǎng)24h，檢測細(xì)胞的增殖和自噬程度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 所有實(shí)驗重復(fù)3次，實(shí)驗數(shù)據(jù)使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，P值計算采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1刀豆素A對乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7的抑制作用

與未加ConA的PBS組比較，MCF-7細(xì)胞在不同濃度ConA的作用下均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)，且呈劑量依賴性（P＜0.01）。而MCF-7細(xì)胞用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后再加ConA培養(yǎng)，ConA對MCF-7細(xì)胞的抑制作用相比于未用3-MA預(yù)處理組明顯減弱（P＜0.01），提示刀豆素A通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞過度的自體吞噬效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，見表1。

表1 不同濃度刀豆素A對MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制作用（）

表1 不同濃度刀豆素A對MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制作用（）

注：與PBS組比較，**P＜0.01；與不加3-MA的40μg/mL ConA組比較，△△P＜0.01

2.2刀豆素A對乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7自體吞噬的誘導(dǎo)效應(yīng) 與未加ConA的PBS組比較，MCF-7細(xì)胞在不同濃度ConA的作用下LC3-Ⅱ和BNIP3的表達(dá)均明顯升高。而MCF-7細(xì)胞用3-MA預(yù)處理后再加ConA培養(yǎng)，LC3-Ⅱ的表達(dá)相比于未加3-MA組顯著減少（P＜0.05），而BNIP3的表達(dá)則不受影響（P＞0.05）。進(jìn)一步說明刀豆素A能誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生自體吞噬，見表2。

表2 不同濃度刀豆素A對MCF-7腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響（）

表2 不同濃度刀豆素A對MCF-7腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響（）

注：與PBS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與40μg/mL ConA組比較，△△P＜0.01

組別PBS組10μg/mL ConA組20μg/mL ConA組40μg/mL ConA組40μg/mL ConA+3mM 3-MA組n/孔3-MA濃度/mM 33333 ConA濃度/（μg/mL）0 10 20 40 40 00003灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）0.01±0.01 0.24±0.05** 0.52±0.14** 0.73±0.12** 0.38±0.13**△△灰度比（BNIP3/β-actin）0.20±0.07 0.29±0.10* 0.61±0.18** 0.84±0.14** 0.80±0.15**

2.3BNIP3表達(dá)對刀豆素A發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響 用BNIP3 siRNA沉默BNIP3的表達(dá)后，與加無關(guān)siRNA的對照組相比，ConA對MCF-7細(xì)胞的抑制作用明顯降低（P＜0.01），同時ConA誘導(dǎo)的自體吞噬效應(yīng)也明顯降低（P＜0.01）。說明刀豆素A通過上調(diào)BNIP3的表達(dá)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自體吞噬而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，見表3。

表3 BNIP3 siRNA對刀豆素A發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（）

表3 BNIP3 siRNA對刀豆素A發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（）

注：與ConA+無關(guān)siRNA組比較，**P＜0.01

組別ConA+無關(guān)siRNA組ConA+BNIP3 siRNA組n/孔33 ConA濃度/（μg/mL）40 40 BNIP3 siRNA/nM 0 100無關(guān)siRNA/nM 100 0灰度比（BNIP3/β-actin）0.89±0.17 0.38±0.12**灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）0.65±0.14 0.33±0.13**抑制率/% 81.5±7.2 42.3±4.3**

3 討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，ConA能引起一種新型的程序性死亡方式-自體吞噬。自體吞噬過程是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白并使其包被進(jìn)入囊泡的過程，受一系列自噬相關(guān)基因的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)很多促自噬因子都能抑制癌癥發(fā)生，相對的，一些自噬負(fù)調(diào)節(jié)因子促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。這些分子是直接通過調(diào)節(jié)自噬來影響腫瘤發(fā)生還是通過另外的信號通路影響腫瘤目前仍不清楚。高度自噬能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，自噬缺失會使某些組織器官（如乳腺、前列腺等）對代謝性應(yīng)激敏感性增加，易于使DNA受到損傷，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[7]，自體吞噬與腫瘤細(xì)胞的生存和增殖密切相關(guān)。本研究通過3-MA抑制了刀豆素A引起的MCF-7細(xì)胞的自噬及殺傷活性，證實(shí)了ConA通過誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞發(fā)生高度自噬，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

Bcl-2家族成員在凋亡過程中扮演重要角色，所有的 Bcl-2成員都至少具有四個同源結(jié)構(gòu)域（BH1-BH4）中的一個，這些結(jié)構(gòu)域的不同組合決定其是誘導(dǎo)還是抑制凋亡。BNIP3是包含單BH3區(qū)的促凋亡成員，屬于BH3-only亞家族，研究表明BNIP3在細(xì)胞死亡的傳導(dǎo)途徑中有十分重要的作用，它的高度表達(dá)能誘導(dǎo)非凋亡性的程序性死亡即自噬性死亡[8]。因此提高腫瘤細(xì)胞BNIP3的表達(dá)有可能起到治療腫瘤的作用，探索并開發(fā)具有提高BNIP3表達(dá)的天然藥物，在腫瘤治療方面具有廣闊的前景，刀豆素A正是一種天然藥物，它不但能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能對抗腫瘤，而且還能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，本文的研究為刀豆素A抗腫瘤治療的應(yīng)用提供了實(shí)驗和理論依據(jù)。

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修回日期：2014-06-15

Effect of Concanavalin A Induced Autophagic Cell Death in Breast Cancer Cells and the Mechanism

CHEN Honglei，JIANG Kai. Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect of concanavalin A on proliferation of MCF-7 cells and the underlying mechanism.MethodsMCF-7 cells were treated with different concentrations of concanavalin A and then the proliferation of MCF-7 was detected by MTT method and LC-3II was labeled.3-MA was added to detect the sensitivity of MCF-7 cells to concanavalin A.After silencing the expression of BNIP3 with small RNA，the proliferation and autophagy of MCF-7 cells treated with concanavalin A were detected.ResultsConcanavalin A signifi cantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells（P＜0.01）and induced autophagic cell death.The expression of BNIP3 significantly increased in MCF-7 cells when treated with ConA（P＜0.05，P＜0.01）.After silencing BNIP3 with small RNA，the effect of inhibition and autophagy of concanavalin A decreased in MCF-7 cells.ConclusionConcanavalin A can induce autophagic cell death of MCF-7 cells via upregulating the expression of BNIP3.

concanavalin A；MCF-7；autophagy；BNIP3

2014-04-30

注：本文第一作者系浙江中醫(yī)藥大學(xué)在職研究生