李倩坤 王盈 張曼玲 楊海元 程俊霖 趙麗華 任子健 陳鳳嬌 萬(wàn)振昆張緯 李榮鳳 戴一凡

器官移植是拯救臟器終末期疾病患者的有效手段之一［1］，但供器官短缺極大地制約了器官移植的發(fā)展。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和倫理學(xué)上的共識(shí)，從動(dòng)物身上尋求患者需要的細(xì)胞、組織、器官，實(shí)現(xiàn)異種移植，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。由于豬的生理和解剖指標(biāo)與人類(lèi)相近，與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相比倫理學(xué)障礙較小，還具有育程短、產(chǎn)仔多、仔豬生長(zhǎng)迅速、易于在無(wú)指定病原體條件下飼養(yǎng)等特點(diǎn)［3］，因此轉(zhuǎn)基因豬已成為研究異種器官移植最具優(yōu)勢(shì)的大動(dòng)物供體。

雖然豬能夠作為組織與細(xì)胞的替代性供體來(lái)源，但在異種移植中需要克服多方面的免疫排斥反應(yīng)［4-5］，如 α-Gal 抗 原 引 起 的 超 急 性 排 斥 反 應(yīng)(hyperacute rejection，HAR)、補(bǔ)體反應(yīng)以及凝血反應(yīng)等。人們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)豬的基因改造和修飾可以降低異種移植后的免疫反應(yīng)［6］。豬MHC 又稱(chēng)豬白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)，是α-Gal 抗原以外的主要異種抗原，敲除SLA Ⅱ不但能夠大大降低豬細(xì)胞的免疫原性，而且能夠避免豬SLA Ⅱ?qū)κ荏wT 細(xì)胞的直接激活作用［7］。Ⅱ類(lèi)反式激活因子(class Ⅱtrans-activator，CⅡTA)作為MHC Ⅱ類(lèi)分子的反式激活因子［8］，由1 130 個(gè)氨基酸殘疾組成，其cDNA 全長(zhǎng)為3 390 bp。1993 年，日內(nèi)瓦大學(xué)Mach 教授實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)CⅡTA［9］。CⅡTA 在MHC Ⅰ/Ⅱ類(lèi)基因和多種抗原遞呈相關(guān)基因如DM、Ii、TAP 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)中起重要調(diào)節(jié)作用，并涉及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)過(guò)程［10］。有研究證實(shí)，CⅡTA 顯性抑制基因可以抑制MHC 的表達(dá)［11］，將體外構(gòu)建的人CⅡTA 基因N 端缺失顯性負(fù)向(CⅡTA dominantnegative，CⅡTA-DN)突變體導(dǎo)入豬的血管內(nèi)皮細(xì)胞后，該突變體可跨越種間屏障獲得表達(dá)，相應(yīng)分子與豬的內(nèi)源性CⅡTA 分子可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MHC 基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)體，因突變體無(wú)轉(zhuǎn)錄活性，從而遏制了豬的MHC基因的表達(dá)，導(dǎo)入CⅡTA-DN 突變體的豬內(nèi)皮細(xì)胞不再引起異種間細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明以CⅡTA-DN 突變體誘導(dǎo)移植耐受具有較好的應(yīng)用前景。

在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們已經(jīng)構(gòu)建了小鼠CⅡTADN 突變體重組載體，并導(dǎo)入高表達(dá)MHCⅡ-DN 類(lèi)分子的細(xì)胞中，從功能上證實(shí)了轉(zhuǎn)染CⅡTA-DN 突變體的細(xì)胞喪失了刺激同種異基因CD4+T 細(xì)胞發(fā)生增殖的能力［12］。我們前期的工作成功構(gòu)建了CⅡTA-DN轉(zhuǎn)基因豬，并且通過(guò)細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)證明了CⅡTA-DN 突變體可以完全抑制抗原呈遞細(xì)胞和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中SLAⅡ類(lèi)分子的表達(dá)［13］。因此，我們將CⅡTA-DN 突變體重組質(zhì)粒加入到已經(jīng)敲除α-Gal并轉(zhuǎn)入膜輔蛋白CD46 和血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞中，希望這一模型豬能夠達(dá)到更好的抑制異種間免疫應(yīng)答的效果，有利于移植器官的存活。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原代豬胎兒成纖維細(xì)胞株181B(DKO/CD46/TM)，來(lái)源于長(zhǎng)白豬與杜洛克豬的雜交品種，由美國(guó)Revivicor 公司惠贈(zèng)。pMD-108T 載體、pST205 載體為本實(shí)驗(yàn)室所有。LB 液體培養(yǎng)基:含1% 胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉，高壓滅菌25 min備用;液體培養(yǎng)基中加入1%瓊脂即為固體培養(yǎng)基。DMEM、PBS、0. 25% 胰酶等購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒 Lipofectamine?2000、克隆細(xì)胞抗性篩選藥物博來(lái)霉素(Zeocin)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。特級(jí)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司。PCR 產(chǎn)物純化膠回收試劑盒購(gòu)自德國(guó)MN 公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司，限制性?xún)?nèi)切酶Xhol、MluI、T4 DNA 連接酶等均購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司，大腸桿菌DH5α、核酸標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker(DL2000)、1k bp Ladder 等均購(gòu)自TaKaRa 生物工程有限公司，2 ×Taq Master Mix 購(gòu)自美國(guó)Vazyme 公司，NP-40 細(xì)胞裂解液購(gòu)自生興生物技術(shù)(南京)有限公司，Tris、EDTA、0.5% SDS、DMSO、DEPC 水、蛋白酶K、克隆杯、細(xì)胞松馳素B、PZM-3 及HEPES 等均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pNMU105/CⅡTA-DN 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)目的基因堿基序列，設(shè)計(jì)合成Zeocin 抗性基因片段BGH-loxp-Zeo-Sv40pa-loxp(1 443 bp)，將其置于pMD-108T 載體，構(gòu)成pNMU104 載體。利用Xhol 和 MluI 雙 酶 切 pNMU104 載 體 和 含 有CⅡTA-DN基因的pST205 質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，涂布接種含氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基，次日挑取菌落，離心收集菌體，利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行Xhol 和MluI 雙酶切鑒定，得到最終重組質(zhì)粒，命名為pNMU105(圖1)。

1.2.2 質(zhì)粒pNMU105 的提取和轉(zhuǎn)染

按照質(zhì)粒中提試劑盒的操作步驟提取質(zhì)粒pNMU105。離心收集菌體，溶解菌體并依次處理，最終加入異丙醇沉淀DNA 并用70%乙醇洗滌。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切線(xiàn)性化，并用無(wú)水乙醇法純化，溶于DEPC 水，終濃度為2 823 ng/μL。一方面，通過(guò)線(xiàn)性化后的條帶大小可以驗(yàn)證提取質(zhì)粒的正確性;另一方面，將質(zhì)粒線(xiàn)性化后便于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine?2000 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將純化的pNMU105 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至181B 細(xì)胞。181B 細(xì)胞培養(yǎng)于含有20%特級(jí)胎牛血清、5 ng/mL bFGF 的DMEM 培養(yǎng)基中。

1.2.3 單克隆細(xì)胞的篩選、挑取和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前期，我們已利用含有Zeocin 遞增濃度的培養(yǎng)液(0 ～500 μg/mL)，對(duì)181B 細(xì)胞的生長(zhǎng)與死亡情況完成了相關(guān)藥物篩選濃度的測(cè)試，決定選擇350 μg/mL 作為Zeocin 對(duì)181B 細(xì)胞的篩選濃度，篩選7 ～10 d 后可視細(xì)胞生長(zhǎng)情況降低藥物濃度。進(jìn)行正式轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)24 h 后，將181B 細(xì)胞分至10 個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，基于藥物篩選濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用含Zeocin 培養(yǎng)基篩選，2 ～3 d 換液1 次;同時(shí)，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。藥物篩選期間拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。據(jù)細(xì)胞篩選情況，Zeocin 濃度由起初350 μg/mL 調(diào)整至200 μg/mL。

藥物篩選后第8 天，開(kāi)始陸續(xù)有單克隆細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生。用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底圈劃標(biāo)記，在超凈臺(tái)內(nèi)去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，并用PBS 緩沖液清洗2 ～3 遍，根據(jù)單克隆細(xì)胞團(tuán)的大小選擇相應(yīng)尺寸的克隆杯，扣套于單克隆細(xì)胞團(tuán)周?chē)?，向克隆杯里加入少?.25%胰酶進(jìn)行消化，吸取杯內(nèi)單細(xì)胞懸液至48 孔板。長(zhǎng)滿(mǎn)后80%的細(xì)胞傳代至12 孔板;20%留于原48 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，以備后期檢測(cè)CⅡTA-DN 基因是否轉(zhuǎn)入。待12 孔板的細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，選擇狀態(tài)佳的克隆細(xì)胞凍存于含DMSO 的凍存液中。

1.2.4 PCR 檢測(cè)CⅡTA-DN 基因在181B 克隆細(xì)胞中的轉(zhuǎn)入

實(shí)驗(yàn)前期，我們?cè)O(shè)計(jì)了12 對(duì)CⅡTA-DN 引物，并以pNMU105/CⅡTA-DN 質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照、以擴(kuò)增未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B 細(xì)胞DNA 不可見(jiàn)對(duì)應(yīng)雜帶為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)引物PCR 擴(kuò)增效率進(jìn)行了測(cè)試，最終選用效率最高的引物對(duì)所有轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。48 孔板中細(xì)胞再次長(zhǎng)滿(mǎn)后，配制NP40 細(xì)胞裂解液并提取單克隆細(xì)胞基因組，用事先經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試的CⅡTA-DN 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物的5'端分別引入MluI 限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。上游引物序列:5'-GGG AAA GCT TGT GCA GAC TC-3';下游引物序列:5'-GCT GAT CCG TGA ATC CTG TT-3'。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用pNMU105 質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B細(xì)胞作為陰性對(duì)照，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行目的基因檢測(cè)。

1.2.5 豬體細(xì)胞核移植和胚胎移植

圖1 pNMU105/CⅡTA-DN 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)模式圖

采集豬的新鮮卵巢，抽取卵子，顯微鏡下?lián)炻?，并置于體外成熟液中成熟42 ～44 h，用透明質(zhì)酸酶去除初級(jí)卵母細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞，用操作液(HEPES、青霉素、鏈霉素和氯化鈉配制而成)洗3 遍。挑選帶有第一極體的卵細(xì)胞置于含有細(xì)胞松弛素B 的操作液中，選取狀態(tài)最佳的CⅡTA-DN 轉(zhuǎn)基因181B 克隆細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植。顯微操作去核、注核、電融合等步驟后，放入含有PZM-3 的發(fā)育液中培養(yǎng)，5 d 后將發(fā)育的囊胚注射植入代孕豬的子宮，完成胚胎移植。移植工作連續(xù)進(jìn)行4 周，每周移植體細(xì)胞核400 ～800 個(gè)，體外培養(yǎng)獲得囊胚80 ～200 個(gè)，每只代孕豬每次移植胚胎數(shù)80 ～100 個(gè)，共植入4 ～6 只代孕豬。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因豬的鑒定分析

轉(zhuǎn)基因豬出生后，取仔豬耳源組織，用眼科剪等手術(shù)器械將組織剪碎，加入組織裂解液(50 mmol/L Tris，pH 8.0;100 mmol/L EDTA;0.5%SDS)和蛋白酶K，水浴55 ℃過(guò)夜。次日吸取上清，利用酚氯仿法抽提組織細(xì)胞DNA，并用無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇漂洗。獲取的DNA 分別用CⅡTA-DN 引物進(jìn)行PCR 鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)載體pNMU105/CⅡTA-DN 的鑒定

提取的pNMU105 質(zhì)粒利用限制性?xún)?nèi)切酶Xhol和MluI 進(jìn)行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察可見(jiàn)8 000 bp與10 677 bp 處存在明顯條帶，證明質(zhì)粒提取正確(圖2)。

圖2 pNMU105 質(zhì)粒酶切鑒定圖譜

2.2 pNMU105/CⅡTA-DN 轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞的鑒定

2.2.1 Zeocin 抗性藥物篩選結(jié)果

鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn):未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B 細(xì)胞數(shù)量第1，2 天呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，第3 天部分細(xì)胞開(kāi)始死亡，5 d 后細(xì)胞所剩無(wú)幾;轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B 細(xì)胞初期的細(xì)胞狀態(tài)和未轉(zhuǎn)染相比基本同步，第3 天細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少，第5 天有單細(xì)胞散落分布，第7 天發(fā)現(xiàn)有單克隆細(xì)胞團(tuán)落生成趨勢(shì)(圖3)。

2.2.2 克隆細(xì)胞的獲取情況

藥物篩選后第8 天，開(kāi)始陸續(xù)有緊實(shí)的單克隆細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生(圖4)。共挑取138 個(gè)克隆，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，選取較好的克隆進(jìn)行凍存，最終獲得51 個(gè)克隆，其中包括40 個(gè)單克隆和11 個(gè)多克隆。

2.3 CⅡTA-DN 基因在181B 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)入鑒定

181B 克隆細(xì)胞基因組由C ⅡTA-DN 引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可以看到多數(shù)克隆細(xì)胞出現(xiàn)1 條與pNMU105 質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照一致的條帶，大小為592 bp;而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的181B 細(xì)胞在相應(yīng)位置無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，提示出現(xiàn)592 bp 特異性條帶的為陽(yáng)性克隆(圖5)。51 個(gè)克隆細(xì)胞中最終經(jīng)鑒定CⅡTA-DN 陽(yáng)性克隆33 個(gè)。

2.4 轉(zhuǎn)基因豬的鑒定結(jié)果

胚胎移植15 周后，共有10 只轉(zhuǎn)基因豬出生(圖6)。取轉(zhuǎn)基因豬的耳緣組織，裂解并提取組織細(xì)胞的基因組，由CⅡTA-DN 引物進(jìn)行PCR 和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，轉(zhuǎn)基因豬均出現(xiàn)與pNMU105 質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照大小一致的特異性條帶(圖7)。

所有轉(zhuǎn)基因仔豬舌部均有邊緣肥大畸形，2 只出現(xiàn)后肢無(wú)力。舌部的畸形使仔豬的外呼吸功能受到相應(yīng)影響，進(jìn)食受到嚴(yán)重阻礙，3 ～5 d 后轉(zhuǎn)基因豬陸續(xù)死亡。

3 討 論

圖3 Zeocin 藥物篩選時(shí)不同時(shí)間段細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖4 轉(zhuǎn)染得到的部分具有Zeocin 抗性的181B 克隆細(xì)胞

圖5 部分具有Zeocin 抗性的181B 克隆細(xì)胞的PCR 鑒定結(jié)果

圖6 出生10 h 的轉(zhuǎn)基因豬

圖7 轉(zhuǎn)基因豬PCR 鑒定結(jié)果

在異種移植中，人體的免疫系統(tǒng)通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)對(duì)“異己成分”進(jìn)行攻擊、破壞和清除，從而誘發(fā)各型變態(tài)反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮受損，導(dǎo)致血管壁炎癥、血栓形成和組織壞死［14］。HAR 是異種移植成功的首要障礙，是由豬細(xì)胞表面α-Gal 抗原導(dǎo)致［15］。α-Gal 抗原是一組糖蛋白或糖脂類(lèi)物質(zhì)，由α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)催化合成，而人類(lèi)、猿、舊大陸猴不表達(dá)有活性的GGTA1。因此，敲除豬GGTA1 基因能夠有效阻止α-Gal 抗原的形成，從根本上有效抑制異種移植中HAR 的發(fā)生。膜輔蛋白CD46 分子屬于補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白基因簇的成員，可以抑制補(bǔ)體的激活，保護(hù)自身宿主細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解破壞;并且作為參與T 細(xì)胞激活的共刺激分子［16-17］，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10 和TGF-β，從而抑制移植免疫反應(yīng)［18］。TM 與凝血酶結(jié)合后可降低凝血酶的凝血活性，從而加強(qiáng)其激活蛋白C 的活性，激活的蛋白C 具有抗凝作用，從而發(fā)揮抗凝血作用。因此，敲除α-Gal 并轉(zhuǎn)入CD46、TM 基因能夠在很大程度上對(duì)抗異種移植中的免疫排斥反應(yīng)［19］。最近的結(jié)果證實(shí)了這些預(yù)測(cè)，取得了令人鼓舞的結(jié)果:在適當(dāng)?shù)拿庖咭种茥l件下，將CD46 轉(zhuǎn)基因豬的胰島移植給食蟹猴，食蟹猴能夠存活400 d 以上，并完全治愈其糖尿?。?0］;而敲除α-Gal、轉(zhuǎn)入CD46 和TM 的轉(zhuǎn)基因豬的心臟已能在狒狒體內(nèi)存活400 d以上［21］。為了克服各種免疫排斥反應(yīng)，人們已經(jīng)陸續(xù)將豬GGTA1 基因敲除來(lái)阻止細(xì)胞表面α-Gal 抗原的形成，從而有效避免HAR 的發(fā)生［22］，并且轉(zhuǎn)入CD46 基因和TM 基因以抑制補(bǔ)體的激活和凝血的發(fā)生。然而，豬和人的內(nèi)皮細(xì)胞通常都表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子［23］，在移植免疫應(yīng)答中，供者M(jìn)HCⅡ類(lèi)分子可能在激活受者的T 細(xì)胞直接識(shí)別中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，CⅡTA-DN 突變體對(duì)MHCⅡ表達(dá)具有明顯的抑制作用。為了避免異種移植后豬MHCⅡ類(lèi)分子對(duì)人CD4+T 細(xì)胞的激活，將CⅡTA-DN 基因加入到已經(jīng)敲除α-Gal 并轉(zhuǎn)入CD46、TM 基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞中，以更好地抑制MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)［24］。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示［13］，CⅡTA-DN單基因轉(zhuǎn)基因豬抗原呈遞細(xì)胞SLAⅡ類(lèi)分子的表達(dá)明顯減少，與陰性對(duì)照相比減少40% ～50%，經(jīng)炎癥因子刺激的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中SLAⅡ類(lèi)分子表達(dá)被100% 抑制。人CD4+T 細(xì)胞對(duì)CⅡTA-DN豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)顯著低于陰性對(duì)照，60% ～80%被抑制。因此，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的DKO/CD46/TM/CⅡTA-DN 轉(zhuǎn)基因豬的細(xì)胞和器官應(yīng)該能夠更好地避免異種移植后的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

由于轉(zhuǎn)基因豬畸形與死亡的出現(xiàn)，我們探究和分析了從材料到操作的每一個(gè)層面，發(fā)現(xiàn)畸形的出現(xiàn)可能有以下原因:(1)重復(fù)克隆。逐一敲除免疫相關(guān)基因?qū)?xì)胞基因組的改造可能會(huì)對(duì)細(xì)胞染色體功能基因產(chǎn)生影響。每次轉(zhuǎn)入敲除某一功能的表達(dá)載體，新的基因整合到原細(xì)胞的基因組，引起堿基片段的缺失或替換，從而導(dǎo)致染色體異常，造成基因突變。因此，我們將嘗試?yán)肁20 系統(tǒng)一次性轉(zhuǎn)染兩個(gè)或兩個(gè)以上基因，以避免多次克隆對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。(2)Zeocin 的不良反應(yīng)。在生殖生物學(xué)相關(guān)研究中，一定實(shí)驗(yàn)濃度的Zeocin 具有誘導(dǎo)染色體DNA 雙鏈損傷的作用，因此不能排除Zeocin 對(duì)克隆動(dòng)物染色體的影響。在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們可選擇Puromycin 等抗性基因替代Zeocin 發(fā)揮篩選作用。(3)原代細(xì)胞本身的質(zhì)量、轉(zhuǎn)染方式、體細(xì)胞核移植操作方法以及胚胎移植的季節(jié)選擇等方面尚有待探究［25］。

對(duì)于引起轉(zhuǎn)基因仔豬死亡的原因，舌部畸形可能是其中的重要因素之一。由于轉(zhuǎn)基因豬的組織、器官將用于異種移植，因此必須對(duì)其重要臟器功能進(jìn)行分析檢測(cè)。在后續(xù)的工作計(jì)劃中，我們將會(huì)重點(diǎn)通過(guò)免疫組化、各種生理生化指標(biāo)對(duì)重要臟器進(jìn)行功能檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因豬的畸形和死亡讓我們對(duì)傳統(tǒng)的多次重復(fù)克隆產(chǎn)生了新的思考，為今后的異種器官移植工作中改進(jìn)多個(gè)基因轉(zhuǎn)入途徑與選擇抗性篩選藥物等方面提供了借鑒和啟示。

總之，為了異種移植中更加有效地減少免疫損傷、提高移植器官的存活率，我們通過(guò)新型基因改造豬的培育，在抑制HAR 和補(bǔ)體反應(yīng)、降低凝血和人CD4+T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的理論基礎(chǔ)上進(jìn)行了克隆模型豬的構(gòu)建，做出了新的嘗試，為將來(lái)異種器官移植的臨床應(yīng)用以及解決供器官短缺等增添了新的思路和希望。

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