陳鷗 胡旭琪 鄭旭浩 蔣良福

雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)在周圍神經(jīng)再生中能發(fā)揮修復(fù)作用，廣泛應(yīng)用于組織工程。但自體SCs 來源有限，增殖能力低，培養(yǎng)周期長，難以滿足組織工程需要［1］，而使用異體SCs 又存在免疫排斥問題。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)有多向分化能力，目前大量研究發(fā)現(xiàn)ADMSCs 經(jīng)誘導(dǎo)可分化為SCs，并能應(yīng)用于去細(xì)胞異體神經(jīng)移植，發(fā)揮外周神經(jīng)修復(fù)作用［1-3］。但是，去細(xì)胞異體神經(jīng)是一種無血供的移植物，早期不能及時建立血液循環(huán)，從而造成了低氧微環(huán)境。大部分研究認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧環(huán)境中存活率很低，低氧時3 ～4 d 內(nèi)就會死亡［4-5］。本研究模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，探討低氧對ADMSCs 向SCs 分化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原酶、全反式維甲酸、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰島素、吲哚美辛及IBMX 均購自美國Sigma 公司。胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基及青鏈霉素均購自美國Gibco 公司，β-巰基乙醇購自美國Amresco 公司。腺苷酸環(huán)化酶激活劑、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子及神經(jīng)膠質(zhì)生長因子均購自英國Peprotech 公司。兔抗大鼠CD44 抗體、兔抗大鼠CD45 抗體及兔抗大鼠CD90 抗體均購自美國Biolegend 公司。兔抗大鼠S-100抗體、兔抗大鼠GFAP 抗體均購自美國Abcam公司，兔抗大鼠GAPDH 抗體購自美國Proteintech Group 公司。茜素紅、油紅O 購自浙江天杭生物科技有限公司。MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、DAPI、RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、DAB 顯色試劑盒、羊抗兔Ig G 二抗及TBST 緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CX41 倒置顯微鏡、BX51熒光顯微鏡均購自日本奧林巴斯公司。FACS Aria流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。ELX808 酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Tek 公司。ChemiDocTMMP 凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 大鼠ADMSCs 的分離

選取清潔級雄性近交系SD 大鼠10 只(購自溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，體質(zhì)量180 ～200 g，2 月齡。參照參考文獻(xiàn)［6］從大鼠脂肪組織提取ADMSCs 的方法并加以改良，分離ADMSCs:大鼠麻醉后取雙側(cè)睪丸周圍脂肪組織，去除肉眼可見血管，剪成1 mm×1 mm ×1 mm 大小方塊，0.1% Ⅰ型膠原酶震蕩消化60 min，等體積DMEM/F12 終止消化。200 目細(xì)胞篩過濾，200 ×g 離心10 min，去上清液。用含15%胎牛血清的DMEM/F12 重懸沉淀并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后換液并去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 天換液1 次。細(xì)胞匯合度達(dá)80%時用0.25%胰酶消化傳代。

1.3 大鼠ADMSCs 的鑒定

選取傳代后的第3 代細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀鑒定CD44、CD45 和CD90等細(xì)胞表面標(biāo)志:0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入100 μL PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，1000 r/min (離心半徑18 cm)，離心5 min，去上清。分別加入兔抗大鼠CD44、CD45 和CD90 抗體2 μL，室溫避光孵育30 min，加入100 μL PBS 緩沖液洗滌去除多余抗體，上機(jī)檢測。成骨、成脂能力的鑒定:細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含0.1 μmol/L 地塞米松，50 μg/mL 抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)誘導(dǎo)2 周及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 吲哚美辛，0.5 μmol/L IBMX，10 mg/L 胰島素)誘導(dǎo)2 周后，分別用茜素紅染色以及油紅O 染色。

1.4 分組和誘導(dǎo)

選取傳代后的第3 代細(xì)胞按1 ×104/mL 接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞匯合度達(dá)80%后，將細(xì)胞隨機(jī)分成3 組。(1)常氧誘導(dǎo)組:于5% CO2、21% O2、37 ℃條件下誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時加入含1 mmol/L β-巰基乙醇的DMEM/F12 培養(yǎng)液誘導(dǎo)，24 h 后去除培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗，加入含40 ng/mL 全反式維甲酸的DMEM/F12 培養(yǎng)液誘導(dǎo)，72 h 后去除培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗，加入含5 ng/mL 血小板源性衍生因子、10 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、14 μmol/L 腺苷酸環(huán)化酶激活劑、200 ng/mL 神經(jīng)膠質(zhì)生長因子的DMEM/F12 培養(yǎng)液誘導(dǎo)14 d，每3 天換液1 次。(2)低氧處理+常氧誘導(dǎo)組:先將細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、0.5% O2、37 ℃培養(yǎng)箱中24 h［7］，隨后轉(zhuǎn)移至5% CO2、21% O2、37 ℃條件下誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方式同常氧誘導(dǎo)組。(3)低氧誘導(dǎo)組:于5% CO2、0.5% O2、37 ℃條件下誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方式同常氧誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)完成后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 MTT 法檢測各組細(xì)胞增殖情況

誘導(dǎo)結(jié)束后，0.25%胰酶消化各組細(xì)胞并以1 ×103個/孔的密度接種于96 孔板，每孔200 μL，使用含15% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后每孔加入20 μL MTT 試劑，同時設(shè)空白調(diào)零孔，孵育4 h。加入MTT 溶解液150 μL，低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀讀取570 nm 波長處A 值。

1.6 免疫熒光染色檢測GFAP 和S-100 表達(dá)

各組細(xì)胞完成誘導(dǎo)后，制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定。羊血清封閉非特異性位點，分別滴加兔抗大鼠GFAP 抗體(1 ∶300)與兔抗大鼠S-100 抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，滴加熒光標(biāo)記的羊抗兔lg G 二抗，常溫孵育1 h，用DAPI 對細(xì)胞核染色后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot 檢測GFAP 和S-100 表達(dá)

收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。配制5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳分離蛋白后，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5% 脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗大鼠GFAP 一抗(1 ∶300)、兔抗大鼠S-100 一抗(1 ∶100)以及兔抗大鼠GAPDH 一抗(1 ∶8 000)，37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次，5 min/次。加入羊抗兔IgG 二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，DAB 顯色試劑盒進(jìn)行顯色。ChemiDocTMMP 凝膠成像分析系統(tǒng)分析各組蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間ADMSCs增殖情況比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADMSCs 鑒定結(jié)果

倒置顯微鏡觀察可見分離后的細(xì)胞貼壁生長，呈成纖維細(xì)胞樣，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記發(fā)現(xiàn):細(xì)胞表面CD44和CD90 表達(dá)陽性，而造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD45表達(dá)陰性(圖1)。成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2 周后，細(xì)胞茜素紅染色(圖2)及油紅O 染色(圖3)陽性，提示該細(xì)胞具有ADMSCs 表型及多向分化能力，證明ADMSCs 分離培養(yǎng)成功。

2.2 誘導(dǎo)后的ADMSCs 形態(tài)學(xué)觀察

常氧誘導(dǎo)組、低氧處理+常氧誘導(dǎo)組ADMSCs在誘導(dǎo)14 d 后，可見細(xì)胞呈梭形生長，出現(xiàn)有光暈的突起，相鄰細(xì)胞突起之間相互連接，呈樹杈狀排列，可見兩極突起。低氧誘導(dǎo)組ADMSCs 在誘導(dǎo)14 d后，可見大量細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長，出現(xiàn)較圓鈍、無明顯光暈的突起，未見兩極突起(圖4)。提示常氧誘導(dǎo)組、低氧處理+常氧誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)后出現(xiàn)SCs 形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞未出現(xiàn)SCs 形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD44、CD45、CD90 表達(dá)

圖2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2 周后茜素紅染色陽性(×100)

圖3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2 周后油紅O 染色陽性(×100)

圖4 各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.3 各組ADMSCs 的增殖情況

MTT 法檢測結(jié)果顯示，低氧處理+常氧誘導(dǎo)組A 值為0. 861 ±0. 039，高于常氧誘導(dǎo)組0. 837 ±0.017，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。低氧誘導(dǎo)組A 值為0.931±0.041，均高于常氧誘導(dǎo)組和低氧處理+常氧誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)。提示低氧環(huán)境可以造成ADMSCs 增殖能力增強(qiáng)。

2.4 各組ADMSCs GFAP 和S-100 的表達(dá)情況

免疫熒光染色結(jié)果顯示，常氧誘導(dǎo)組和低氧處理+常氧誘導(dǎo)組大量ADMSCs GFAP 和S-100 表達(dá)陽性，低氧誘導(dǎo)組僅少量ADMSCs GFAP 和S-100表達(dá)陽性(圖5 ～6)。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)常氧誘導(dǎo)組S-100 蛋白表達(dá)最高，低氧處理+常氧誘導(dǎo)組GFAP 蛋白表達(dá)最高，低氧誘導(dǎo)組S-100 蛋白、GFAP蛋白表達(dá)最低(圖7 ～8)。

3 討 論

ADMSCs 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的干細(xì)胞表型，均具有多向分化能力，能向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等成體細(xì)胞分化，還可以向SCs 分化并具有SCs 的功能［6，8-9］。Kingham 等［9］發(fā)現(xiàn)體外分化形成的SCs 與NG-108 細(xì)胞共培養(yǎng)后，能促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長。Rosova 等［10］研究認(rèn)為體內(nèi)環(huán)境氧濃度約為1% ～7%，與體外培養(yǎng)環(huán)境供氧條件有明顯的差別，細(xì)胞外氧濃度是影響細(xì)胞生物學(xué)功能的重要因素，低氧濃度影響間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)組ADMSCs 增殖能力最高，低氧處理+常氧誘導(dǎo)組ADMSCs 增殖能力高于常氧誘導(dǎo)組，提示低氧環(huán)境能促進(jìn)誘導(dǎo)后的ADMSCs 增殖。Grayson 等［11-12］通過體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，低氧能促進(jìn)其增殖能力，提高干細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)水平，這與本研究結(jié)果較為一致。Valorani 等［13］研究表明，低氧培養(yǎng)雖然縮短間充質(zhì)干細(xì)胞分裂時間，但會降低其分化能力。其可能的機(jī)制為:(1)低氧激活ERK1/2、P38 有絲分裂原激活蛋白激酶及PI3K/Akt 信號通路，增強(qiáng)細(xì)胞再生能力;(2)低氧抑制Wnt 信號通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路;(3)低氧會提高低氧誘導(dǎo)因子2α的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Oct-4 的表達(dá)，而Oct-4 是維持間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化特性和自我更新的關(guān)鍵基因［14-15］。

圖5 熒光顯微鏡下各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞GFAP 表達(dá)情況(免疫熒光染色，×200)

圖6 熒光顯微鏡下各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞S-100 表達(dá)情況(免疫熒光染色，×200)

圖7 各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞GFAP 蛋白條帶及條帶灰度值

圖8 各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的S-100 蛋白條帶及條帶灰度值

GFAP 是一種中間絲蛋白，S-100 是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，二者均在SCs 中大量表達(dá)，是SCs 的重要標(biāo)記物。本研究中，常氧誘導(dǎo)組和低氧處理+常氧誘導(dǎo)組的GFAP 和S-100 蛋白表達(dá)明顯高于低氧誘導(dǎo)組，表明低氧環(huán)境抑制ADMSCs 向SCs 分化，但經(jīng)過低氧預(yù)處理的ADMSCs 在恢復(fù)正常氧濃度狀態(tài)下可繼續(xù)向SCs 分化。低氧抑制ADMSCs 向SCs 分化的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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