金 丹 王雪峰 王唯一 張 敏 劉 學(xué)

S-100和CD83+DC在喉黏膜病變中的表達(dá)及意義

金 丹 王雪峰△王唯一 張 敏 劉 學(xué)

目的 研究樹突狀細(xì)胞（DC）在聲帶息肉、喉黏膜白斑及聲門型喉鱗癌組織中的表達(dá)差異。方法采用免疫組化方法檢測20例聲帶息肉組織、47例喉黏膜白斑組織、45例聲門型喉鱗癌組織及20例正常喉黏膜組織中S-100+DC及CD83+DC的浸潤情況。結(jié)果聲帶息肉組、喉白斑組、聲門型喉鱗癌組的S-100及CD83+DC數(shù)較正常喉黏膜組明顯增多（P＜0.05）；聲帶息肉組S-100及CD83+DC數(shù)比喉白斑組明顯增多，聲帶息肉組及喉白斑組S-100及CD83+DC數(shù)較聲門型喉鱗癌組有所增加；在喉黏膜白斑組織中重度不典型增生組S-100及CD83+DC數(shù)明顯高于輕、中度不典型增生組（P＜0.05）；高、中分化聲門型喉鱗癌組S-100及CD83+DC數(shù)高于低分化組（P＜0.05）。結(jié)論聲帶息肉、喉黏膜白斑及聲門型喉鱗癌均存在免疫活動異常，DC的變化在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

白斑，口腔；喉腫瘤；喉黏膜；癌，鱗狀細(xì)胞；聲門；樹突細(xì)胞；S100蛋白質(zhì)類；CD83

喉癌是主要的頭頸部惡性腫瘤之一，喉白斑被認(rèn)為是喉癌癌前病變，是喉癌不容忽視的階段。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）是功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞，在初次免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)方面具有獨(dú)特地位[1]。DC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其數(shù)量的減少及功能的障礙是腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視的一個重要原因。本研究利用免疫組化方法檢測正常喉黏膜組織、聲帶息肉、喉白斑病及聲門型喉鱗癌患者病變組織中S-100及CD83+DC的表達(dá)，通過分析DC在不同組織中的變化情況，探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 喉部病變標(biāo)本132例均來源于2009年10月—2013年3月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，聲門型喉鱗癌患者術(shù)前均未接受放、化療，其中正常喉黏膜組20例，男16例，女4例，平均年齡（56.10±6.86）歲。聲帶息肉組20例，男12例，女8例，平均年齡（42.10±7.82）歲。喉白斑組47例，男35例，女12例，平均年齡（50.45±9.44）歲，輕度不典型增生15例，中度不典型增生15例，重度不典型增生17例。聲門型喉鱗癌組45例，男38例，女7例，平均年齡（60.91±8.56）歲。病理學(xué)分級高分化15例，中分化15例，低分化15例。所有標(biāo)本用10％福爾馬林固定后常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人S-100多克隆抗體及兔抗人CD83抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋。

1.2.2 免疫組化檢測 所有標(biāo)本組織S-100和CD83+DC的浸潤情況采取免疫組化染色，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行，其中PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 胞質(zhì)具有樹突狀突起，同時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核呈棕褐色顆粒著色，單純看到細(xì)胞樹突者不能進(jìn)行計(jì)數(shù)，只有確定DC的細(xì)胞核者才進(jìn)行計(jì)數(shù)。在正常喉黏膜組、聲帶息肉組和喉黏膜白斑組低倍鏡下（×100）選取喉黏膜層，更換高倍鏡（×400），計(jì)數(shù)隨機(jī)10個鏡下陽性細(xì)胞總數(shù)。聲門型喉鱗癌組先在低倍鏡下（×100）選取染色較好的區(qū)域，更換高倍鏡（×400）計(jì)數(shù)10個鏡下陽性細(xì)胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S-100及CD83+DC的陽性表達(dá)情況 S-100 及CD83+DC呈棕褐色，單核，胞體呈卵圓形或不規(guī)則形，部分細(xì)胞表面可見長短不等、粗細(xì)不一的突起，S-100及CD83+DC染色位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。在正常喉黏膜僅見少量DC散在于間質(zhì)中。聲帶息肉中DC在上皮和間質(zhì)均有分布，在喉黏膜白斑的黏膜層和黏膜下層間質(zhì)中見DC細(xì)胞呈簇狀或散在分布。聲門型喉鱗癌組織中S100+DC分布于癌組織及癌組織與正常組織交界處，CD83+DC多分布于癌周組織內(nèi)，癌組織中央分布極少見，圖1～8。

2.2 在不同的喉黏膜病變中S-100及CD83+DC的數(shù)量 聲帶息肉組、喉白斑組及聲門型鱗癌組中S-100及CD83+DC數(shù)高于正常喉黏膜組，聲帶息肉組S-100及CD83+DC數(shù)比喉白斑組明顯增多，聲帶息肉組及喉白斑組S-100及CD83+DC數(shù)較聲門型喉鱗癌組有所增加，見表1。

2.3 S-100及CD83+DC數(shù)在喉黏膜白斑組織不同病理分級中的比較 重度不典型增生組S-100及CD83+DC數(shù)明顯高于輕、中度不典型增生組（P＜ 0.05），輕、中度不典型增生組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.1 The number of S-100 and CD83+DC in each group表1 各組中的S-100及CD83+DC數(shù)量（±s）

Tab.1 The number of S-100 and CD83+DC in each group表1 各組中的S-100及CD83+DC數(shù)量（±s）

＊＊P＜0.01；a與正常喉黏膜組比較，b與聲帶息肉組比較，c與喉白斑組比較，P＜0.05

組別正常喉黏膜組聲帶息肉組喉白斑組聲門型喉鱗癌組F n 20 20 47 45 S-100 8.35±2.21 70.85±14.99a23.49±9.51ab16.44±6.75abc206.262＊＊CD83 7.40±2.04 44.35±7.87a19.45±8.32ab13.38±5.64abc124.014＊＊

Tab.2 Relationships between expression of S-100 and CD83+and different pathological grading in Laryngeal leukoplakia表2 S-100及CD83+DC數(shù)與喉黏膜白斑組織不同病理分級的關(guān)系 （±s）

Tab.2 Relationships between expression of S-100 and CD83+and different pathological grading in Laryngeal leukoplakia表2 S-100及CD83+DC數(shù)與喉黏膜白斑組織不同病理分級的關(guān)系 （±s）

＊＊P＜0.01，a與重度不典型增生比較，P＜0.05，表3同

組別輕度不典型增生中度不典型增生重度不典型增生F n 15 15 17 S-100 15.93±3.28a19.33±6.11a33.82±5.89 52.478＊＊CD83 14.00±3.78a15.40±6.09a27.82±6.01 31.923＊＊

2.4 在聲門型喉鱗癌不同分化程度中S-100及CD83+DC數(shù)的表達(dá)情況 高、中分化組S-100及CD83+DC數(shù)明顯高于低分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高、中分化組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.3 The expression of S-100 and CD83+with relationship of different differentiation of glottic squamous cell carcinoma表3 S-100及CD83+DC數(shù)與聲門型喉鱗癌不同分化程度的關(guān)系 （±s）

Tab.3 The expression of S-100 and CD83+with relationship of different differentiation of glottic squamous cell carcinoma表3 S-100及CD83+DC數(shù)與聲門型喉鱗癌不同分化程度的關(guān)系 （±s）

＊＊P＜0.01，a與低分化比較，P＜0.05

組別高分化中分化低分化F n 15 15 15 S-100 20.93±5.02a19.33±4.47a9.06±3.01 34.407＊＊CD83 17.07±5.04a14.93±4.45a8.13±2.85 18.391＊＊

3 討論

樹突狀細(xì)胞作為體內(nèi)最重要的抗原呈遞細(xì)胞，它的功能是提醒適應(yīng)性免疫系統(tǒng)警惕潛在威脅，將外源或致病性的分子（稱為抗原）呈遞給效應(yīng)細(xì)胞，使其對感染或腫瘤生長做出應(yīng)答。本研究顯示，正常喉黏膜中可見DC散在于間質(zhì)中。與正常喉黏膜相比，聲帶息肉組織中有大量的DC浸潤，可能是局部刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的結(jié)果。喉白斑組織中DC數(shù)量較正常增高，表明有炎癥反應(yīng)，也說明細(xì)胞免疫在其發(fā)病中占有重要地位。而喉黏膜白斑組DC數(shù)較聲帶息肉組減少，說明前者比后者的免疫功能減低，提示這是喉黏膜白斑易癌變的一個危險因素。其中輕、中度不典型增生組DC數(shù)較少，表明這些病變沒有被免疫系統(tǒng)有效監(jiān)視，使癌細(xì)胞未受到特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷破壞，導(dǎo)致病變的惡化。隨著不典型增生程度的增加，DC數(shù)量也增多。但是，當(dāng)有較少的DC存在時，病變會從癌前狀態(tài)更加迅速地過渡到癌階段還是反之亦然，現(xiàn)仍難以解釋[2]。病變從喉黏膜白斑發(fā)展到聲門型喉鱗癌，DC數(shù)量減少，說明癌前病變的喉黏膜炎癥等因素的持續(xù)刺激，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體免疫逃逸的發(fā)生，導(dǎo)致癌變，因此喉黏膜白斑組織中免疫系統(tǒng)監(jiān)視功能的減弱是從癌變前的階段向惡性轉(zhuǎn)變的重要原因之一。聲門型喉鱗癌組織中DC數(shù)量減少，可能是由于腫瘤患者機(jī)體免疫應(yīng)答能力減弱、腫瘤細(xì)胞本身對于周圍微環(huán)境的干擾或破壞，抑制腫瘤內(nèi)DC的聚集。在腫瘤微環(huán)境中，DC還可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞，抑制其生長，高、中分化組的聲門型喉鱗癌組織中DC數(shù)明顯高于低分化組，說明腫瘤組織中DC浸潤程度高，容易激活機(jī)體產(chǎn)生有效地抗腫瘤免疫應(yīng)答，因而預(yù)后較好。

S-100是目前最常用的檢測DC的抗體。研究認(rèn)為，S-100幾乎在成熟和未成熟DC上都有表達(dá)[3]。而CD83不僅是成熟DC的主要特征性標(biāo)志，還是DC發(fā)揮其激發(fā)免疫應(yīng)答作用不可或缺的功能性分子[4]。本研究檢測到聲門型喉鱗癌組織中的CD83主要表達(dá)于癌周組織，癌巢內(nèi)少有表達(dá)，根據(jù)S-100在癌組織內(nèi)的表達(dá)情況，說明聲門型喉鱗癌組織中的DC多處于未成熟階段，而未成熟的DC抗原呈遞功能不強(qiáng)，因此癌組織內(nèi)的DC不能激活有效的免疫反應(yīng)，使T細(xì)胞處于無能狀態(tài)，免疫系統(tǒng)不能有效地清除癌細(xì)胞，使喉癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。有學(xué)者認(rèn)為，DC數(shù)量與喉癌的分級之間存在一種間接關(guān)系，DC可作為誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的一個重要組成部分，S-100+DC可作為喉癌預(yù)后良好的因素[2]。 Li等[5]研究證實(shí)S-100及CD83+DC浸潤較多的喉癌患者預(yù)后好。Zhao等[6]報道食管癌癌前病變中的S-100+DC的浸潤密度較大，認(rèn)為這種免疫狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Sprinzl 等[7]對喉癌前病變的DC進(jìn)行免疫組化研究，檢測到輕、中度不典型增生中僅有少量的DC，而在重度不典型增生中DC浸潤明顯增多。

DC在聲帶息肉、喉黏膜白斑及聲門型鱗癌中的數(shù)量變化，說明了三種病變中均有免疫活動的異常，喉黏膜白斑組織中DC數(shù)量及功能的異常，造成無效的免疫監(jiān)視功能，是從癌前病變向惡性轉(zhuǎn)變的重要線索。

Fig.1 The expression of S-100+DC inlaryngeal normal mucosa (SP,×400)圖1 S-100+DC在正常喉黏膜的表達(dá)(SP,×400)

Fig.2 The expression of CD83+DC in laryngeal normal mucosa (SP,×400)圖2 CD83+DC在正常喉黏膜的表達(dá)(SP,×400)

Fig.3 The expression of S-100+DC in Vocal cord polyp(SP,×400)圖3 S-100+DC在聲帶息肉中的表達(dá)(SP,×400)

Fig.4 The expression of CD83+DC in Vocal cord polyp(SP,×400)圖4 CD83+DC在聲帶息肉中的表達(dá)(SP,×400)

Fig.5 The expression of S-100+DC in laryngeal leukoplakia (SP,×400)圖5 S-100+DC在喉黏膜白斑的表達(dá)(SP,×400)

Fig.6 The expression of CD83+DC in laryngeal leukoplakia (SP,×400)圖6 CD83+DC在喉黏膜白斑的表達(dá)(SP,×400)

Fig.7 The expression of S-100+DC in glottic squamous cell carcinoma(SP,×400)圖7 S-100+DC在聲門型喉鱗癌的表達(dá)(SP,×400)

Fig.8 The expression of CD83+DC in glottic squamous cell carcinoma(SP,×400)圖8 CD83+DC在聲門型喉鱗癌的表達(dá)(SP,×400)

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（2014-02-13收稿 2014-05-14修回）

（本文編輯 魏杰）

Significance of S-100 and CD83+DC Expression in Laryngeal Mucosa Lesions

JIN Dan，WANG Xuefeng△，WANG Weiyi，ZHANG Min，LIU Xue
Department of Otolaryngology,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China△

E-mail:jzswwang@126.com

ObjectiveTo investigate the infiltration of dendritic cell(DC)in Vocal cord polyp,laryngeal leukoplakia and glottic squamous cell carcinoma，and to observe laryngeal mucosal lesions of the state of the immune microenvironment,and to research significance of DC on the development of glottic squamous cell carcinoma.MethodsThe infiltration of S-100+and CD83+DC in 20 cases of Vocal cord polyp,47 cases of laryngeal leukoplakia,45 cases of glottic squamous cell carcinoma tumor and 20 cases of laryngeal normal mucosa were examined using immunohistochemistry.ResultsThe number of S-100+and CD83+DC were significantly higher in glottic squamous cell carcinoma,laryngeal leukoplakia and vocal cord polyp than that in laryngeal normal mucosa(P＜0.05).The number of S-100+and CD83+DC were higher in laryngeal leukoplakia than that in glottic squamous cell carcinoma(P＜0.05).The number of S-100+and CD83+DC in mild dysplasia and moderate dysplasia were less than that in severe atypical hyperplasia(P＜0.01).In glottic squamous cell carcinoma,S-100+and CD83+DC with poor-differentiated was significantly less than that with well-differentiated(P＜0.01).Conclusion Changes in the number of dendritic cell was found in vocal cord polyp,laryngeal leukoplakia and glottic squamous cell carcinoma,which indicated that there were an abnormal immune status.Changing of dendritic cell in laryngeal mucosa plays an important role in laryngeal cancer development.

leukoplakia,oral;laryngeal neoplasms;laryngeal mucosa;carcinoma,squamous cell;glottis;dendritic cells;S100 protein;CD83

R739.65

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.010

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2012225019）

錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（郵編121000）

△通訊作者 E-mail：jzswwang@126.com