劉 妍徐 勇 高 超張志宏

shRNA沉默CtBP2基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞的增殖作用

劉 妍1徐 勇2△高 超1張志宏2

目的 探討RNA干擾技術(shù)沉默羧基末端結(jié)合蛋白（CtBP）2基因表達(dá)對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖能力的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染shRNA組。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)CtBP2的3條特異性短發(fā)卡RNA（shRNA）模板，構(gòu)建CtBP2-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞。通過RT-PCR檢測(cè)CtBP2 mRNA的表達(dá)水平；采用Western blot法檢測(cè)CtBP2蛋白表達(dá)的水平，運(yùn)用MTT法檢測(cè)沉默CtBP2對(duì)PC3細(xì)胞體外增殖的抑制作用。結(jié)果將CtBP2-shRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌PC3細(xì)胞后，CtBP2 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平均明顯下降。沉默CtBP2表達(dá)后，MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA組的PC3細(xì)胞較空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論CtBP2-shRNA可抑制CtBP2在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提示CtBP2可作為前列腺癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

前列腺腫瘤；細(xì)胞系,腫瘤；RNA干擾；細(xì)胞增殖；羧基末端結(jié)合蛋白

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是危害男性健康最常見的惡性腫瘤[1]。我國(guó)PCa的發(fā)病率近年也呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2]。RNA干擾（RNA inference，RNAi）是一種在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后阻斷基因表達(dá)的新技術(shù)，由雙鏈RNA誘發(fā)的導(dǎo)致同源mRNA高效特異性降解。RNA干擾技術(shù)的建立和發(fā)展，為PCa尤其是晚期PCa提供了全新的治療策略。羧基末端結(jié)合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）基因在進(jìn)化上保守，能與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，參與多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子的功能,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。最近，全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome Wide Association Studies, GWAS）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致PCa危險(xiǎn)因素的CtBP2敏感性位點(diǎn)，證實(shí)CtBP2在PCa組織中的表達(dá)明顯高于正常前列腺組織[5]。本研究通過在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)，以阻斷細(xì)胞中CtBP2的表達(dá)，從而觀察CtBP2基因沉默后對(duì)PC3細(xì)胞增殖能力的影響，以期為PCa患者尋找新的靶向治療基因。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人PCa PC3細(xì)胞系由本研究室凍存。

1.2 主要試劑 從http:∕www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank中獲得人CtBP2和β-actin基因序列，應(yīng)用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen公司合成，各引物序列，見表1。shRNA質(zhì)粒購(gòu)自GeneCopoeia公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司；RNA提取試劑Trizol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millpore公司；血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Newprobe公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自博士德公司。一抗羊抗人CtBP2多克隆抗體和二抗驢抗羊IgG-HRP均購(gòu)自Santa Cruz公司；二甲基亞砜（DMSO）、丙烯酰胺及N,N-二甲基雙丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯（DEPC）均購(gòu)自Sigma公司。

Tab.1 Primers for PCR表1 PCR反應(yīng)引物

1.3 重組質(zhì)粒pUC-U6-shRNA-CtBP2 從GenBank中Ct-BP2 mRNA(NM001290215)上尋找符合特征的靶序列，合成分別針對(duì)其靶編碼區(qū)（838-857位點(diǎn)、1303-1322位點(diǎn)、341-360位點(diǎn)）堿基序列的兩條DNA寡核苷酸鏈（分別為CtBP2-shRNA-1,-2,-3）。合成的2條互補(bǔ)寡核苷酸鏈在退火緩沖液作用下退火，形成具有9個(gè)核苷酸環(huán)的shRNA，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶線性化,在T4 DNA連接酶的作用下，通過其莖上的19 nt反義寡核苷酸與CtBP2 mRNA上的靶序列結(jié)合，誘導(dǎo)CtBP2 mRNA的酶切降解，形成pUC-U6-shRNA-CtBP2重組質(zhì)粒,攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因及氨芐青霉素、嘌呤霉素抗性基因、含U6啟動(dòng)子及BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。CtBP2-shRNA-1序列為5′-CTGCCACATCCTCAACCTG-3′，CtBP2-shRNA-2序列為5′-CCTCGACGTGCATGAGTCA-3′，CtBP2-shRNA-3序列為5′-ACGCAGACTCCTGCAAGTT-3′。

1.4 篩選沉默最佳shRNA序列 根據(jù)GeneCopoeia公司提供的shRNA使用說明書，通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)確定最適篩選濃度，篩選出干擾效果最佳的質(zhì)粒CtBP2-shRNA-1。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 PC3細(xì)胞接種于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染 shRNA組，按照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染后12、24 和48 h檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，分析不同組間細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞mRNA表達(dá) 空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染shRNA組轉(zhuǎn)染到PC3細(xì)胞48 h后，提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s；56℃30 s，循環(huán)24次；72℃60 s；72℃總延伸10 min。以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀上觀察結(jié)果并成像，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因mRNA量，每個(gè)樣品目的基因與內(nèi)參基因的比值，即為校正后的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá) 空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染shRNA組轉(zhuǎn)染到PC3細(xì)胞72 h后，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，10％ SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入1∶500稀釋的一抗在4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶5 000稀釋的二抗孵育，洗膜，應(yīng)用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯示蛋白質(zhì)條帶，暗室曝光，用Quantity One軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.8 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力的變化 在EP管內(nèi)將各組細(xì)胞懸液充分打勻，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后換液。于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，每孔加入MTT試劑10 μL，于37℃5％CO2條件下繼續(xù)孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL∕孔，室溫下置水平搖床搖10 min以充分溶解MTT結(jié)晶。在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上選擇波長(zhǎng)570 nm，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組干擾質(zhì)粒干擾CtBP2后其mRNA的表達(dá) 以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為標(biāo)準(zhǔn)，β-actin為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染shRNA組其mRNA表達(dá)水平，見圖1，證實(shí)CtBP2-shRNA-1干擾質(zhì)粒在mRNA水平上抑制CtBP2基因表達(dá)的效果最為顯著。

Fig.1 Silence effect of CtBP2-shRNA圖1 干擾質(zhì)粒對(duì)CtBP2 mRNA的沉默效果

2.2 CtBP2-shRNA-1干擾CtBP2后其mRNA和蛋白的表達(dá) 空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組PC3細(xì)胞中CtBP2 mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于轉(zhuǎn)染shRNA組（P＜0.05），見表2，圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染 shRNA組對(duì) PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 轉(zhuǎn)染shRNA組在24、48、72 h后，PC3細(xì)胞生長(zhǎng)明顯慢于空白對(duì)照組以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（P＜0.05），空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組PC3細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Fig.2 Western blot detect PC3 cells after transfection CtBP2 protein expression圖2 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PC3細(xì)胞中CtBP2蛋白表達(dá)

Tab.2 Transcription and Expression levels of CtBP2 mRNA and protein in PC3 cells表2 PC3細(xì)胞中CtBP2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況（n=3,±s）

Tab.2 Transcription and Expression levels of CtBP2 mRNA and protein in PC3 cells表2 PC3細(xì)胞中CtBP2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況（n=3,±s）

＊P＜0.05；a與（3）組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組（1）轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（2）轉(zhuǎn)染shRNA組（3）F mRNA 0.790±0.110a0.594±0.256a0.254±0.017 125.614＊蛋白0.826±0.042a0.793±0.038a0.204±0.011 653.764＊

Tab.3 Comparison of PC3 cell proliferation in different groups表3 各處理組不同時(shí)間PC3細(xì)胞增殖率比較（n=3，OD值,±s）

Tab.3 Comparison of PC3 cell proliferation in different groups表3 各處理組不同時(shí)間PC3細(xì)胞增殖率比較（n=3，OD值,±s）

＊P＜0.05；a與（3）組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組（1）轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（2）轉(zhuǎn)染shRNA組（3）F 24 h 0.143±0.005a0.144±0.005a0.133±0.003 11.447＊48 h 0.254±0.020a0.274±0.017a0.152±0.017 77.578＊72 h 0.472±0.029a0.483±0.005a0.242±0.007 372.698＊

3 討論

PCa的發(fā)生與發(fā)展受多個(gè)基因的調(diào)控，分子生物學(xué)的發(fā)展在腫瘤的早期診斷、監(jiān)控和預(yù)后判斷上為臨床提供了重要依據(jù)[6]。近年來，RNA干擾技術(shù)在多種腫瘤的基因治療中被證實(shí)具有強(qiáng)大的基因沉默作用[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究特異性shRNA對(duì)PCa細(xì)胞增殖能力的影響。

CtBP基因作為輔阻遏物與多種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)系而參與到很多生物過程中，如細(xì)胞分化、凋亡、發(fā)育和腫瘤發(fā)生[8]。Kovi等[9]報(bào)道，CtBP2能通過轉(zhuǎn)錄因子基本kruppel樣因子與Bik啟動(dòng)子結(jié)合而替代閱讀框,通過與CtBP2結(jié)合從而清除CtBP2∕BKIF對(duì) Bik啟動(dòng)子的抑制，促進(jìn)由非P53依賴的凋亡途徑使細(xì)胞凋亡。Tsilidis等[5]研究表明，CtBP2中單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與PCa的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，CtBP2的表達(dá)與磷脂酰肌醇激酶3通路的活性相關(guān)，它主要是由上游的胰島素樣生長(zhǎng)因子調(diào)控的。然而，Waters等[10]對(duì)多種族人群的研究發(fā)現(xiàn)，CtBP2中的SNP位點(diǎn)與PCa的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性。因此，本研究進(jìn)一步觀察CtBP2在PCa中的作用機(jī)制，采用RNA干擾技術(shù)沉默CtBP2基因的表達(dá)，以期為前列腺癌基因治療尋找新靶點(diǎn)。

本研究通過3組干擾質(zhì)粒干擾CtBP2基因，將CtBP2-shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)PCa PC3細(xì)胞系中，可有效抑制CtBP2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，證實(shí)CtBP2-shRNA-1干擾質(zhì)粒在mRNA水平上抑制CtBP2基因的表達(dá)效果最為顯著，從而對(duì)CtBP2基因?qū)嵤┗虺聊?。通過PCR和Western Blot的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA組的PC3細(xì)胞CtBP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制；轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA組使CtBP2表達(dá)降低后，PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)較空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組受到了明顯的抑制；空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的PC3細(xì)胞毒性輕微。MTT實(shí)驗(yàn)證明Ct-BP2表達(dá)降低能夠顯著抑制PCa細(xì)胞增殖，證明Ct-BP2在PCa細(xì)胞沉默后對(duì)PCa細(xì)胞的影響對(duì)PCa腫瘤的形成和發(fā)展具有重要作用。由此可以說明CtBP2的表達(dá)與PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有相關(guān)性。因此推測(cè)CtBP2很可能成為一個(gè)新的PCa預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究設(shè)計(jì)合成的靶向CtBP2基因的shRNA成功轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞,沉默CtBP2基因的表達(dá)，并且抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng),說明CtBP2與PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有相關(guān)性。抑制CtBP2的表達(dá)可能成為基因治療PCa的方法之一，從而為臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，RNA干擾方法可能成為腫瘤基因治療的一條新途徑。

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（2014-02-27收稿 2014-06-16修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Study of Effect of CtBP2 Knockout through shRNA on Proliferation of Prostate Cancer Cells

LIU Yan1,XU Yong2△,GAO Chao1,ZHANG Zhihong2
1Prostate Disease Laboratory,Tianjin Institute of Urology,Tianjin 300211,China；2Urology Department,the Second Hospital of Tianjin Medical Univercity
△

E-mail:xuyong8816@sina.com

ObjectiveTo study the effects of shRNA-CtBP2 on the growth of prostate cancer PC3 cells.MethodsThere were three experimental groups in this study，which include blank control group,empty plasmid transfected group and transfected shRNA group.CtBP2 mRNA sequence is targeted by 3 pairs of designed interfering shRNA to built shRNA-Ct-BP2 recombinant plasmid then it is transfected into PC3 cells.Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot assays were used to detect the transcription and expression levels of CtBP2 mRNA and protein,respectively.PC3l proliferation was measured by MTT assay.ResultsBuilting shRNA-CtBP2 recombinant plasmid and transfecting PC3 cells were successful.Transcription and expression levels of CtBP2 mRNA and protein were significantly decreased in shRNA-CtBP2 transfected PC3 cells.After CtBP2 silencing,cell proliferation was blocked in the shRNA-CtBP2 cells compared to that of blank control group(P＜0.01).ConclusionshRNA-CtBP2 could significantly inhibit CtBP2 expression,suppress the growth of PC3 cells,which suggests that CtBP2 may be a new target for PCa gene therapy.

prostatic neoplasms;cell line,tumor;RNA interference;cell proliferation;CtBP

R737.25

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.005

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃（12JCYBJC31400）;天津市科委抗癌重大專項(xiàng)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（12ZCDZSY17200）

1天津市泌尿外科研究所前列腺疾病研究室（郵編300211）;2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科

△通訊作者 E-mail:xuyong8816@sina.com