羅艷敏 何 琦 呂福林 肖 倩張 蕾 仇 玄 晁鳳蕾 唐 勇

（400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)：組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，干細(xì)胞與組織工程學(xué)研究室）

既往研究報(bào)道，人類老年化進(jìn)程中存在認(rèn)知功能的下降，而女性在絕經(jīng)后，由于雌激素水平的降低，認(rèn)知功能下降的進(jìn)程往往會(huì)加速［1］，且絕經(jīng)期提前的女性更易提前出現(xiàn)癡呆［2］。Sherwin回顧了大量相關(guān)的臨床調(diào)查研究，結(jié)果顯示ERT能改善絕經(jīng)后女性的認(rèn)知功能［3］。在對(duì)靈長類動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物OVX模型的研究中也證實(shí)了ERT能夠改善認(rèn)知行為［4，5］。ERT可以改善絕經(jīng)后女性的認(rèn)知功能，這一改變的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)自然成為了研究重點(diǎn)。已有大量研究表明ERT是通過增加大腦皮層和海馬內(nèi)神經(jīng)元的突觸可塑性和樹突棘數(shù)量改善OVX后恒河猴及大鼠的認(rèn)知功能的［6－9］。

過去的研究已經(jīng)證實(shí)老年大腦體積的下降主要是由于大腦白質(zhì)的丟失導(dǎo)致［10］，并且是以白質(zhì)內(nèi)細(xì)小直徑有髓神經(jīng)纖維的大量丟失為主［11］。影像學(xué)與行為學(xué)研究表明，這種年齡相關(guān)的大腦白質(zhì)損害與老年的認(rèn)知功能下降密切相關(guān)［12，13］。前述研究已經(jīng)表明雌激素對(duì)認(rèn)知功能及大腦多處結(jié)構(gòu)有積極影響，那么，雌激素與大腦白質(zhì)的關(guān)系如何呢？有研究表明女性絕經(jīng)后，雌激素水平下降可能是導(dǎo)致白質(zhì)體積下降及其他白質(zhì)病變的重要原因之一［14，15］。運(yùn)用核磁共振成像（MRI）技術(shù)，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)長期ERT可以減少絕經(jīng)后女性大腦白質(zhì)的老年性丟失及高信號(hào)灶［16，17］，而另一些學(xué)者的研究則表明ERT對(duì)絕經(jīng)后女性大腦白質(zhì)的老年性改變并沒有保護(hù)作用，反而會(huì)加重 大腦萎縮［18－20］。可 見，ERT 對(duì) 絕 經(jīng)后女性大腦白質(zhì)體積的影響尚存在爭議。有髓神經(jīng)纖維為大腦白質(zhì)中的重要組分，但目前國、內(nèi)外尚未見ERT對(duì)絕經(jīng)后大腦白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維作用的研究報(bào)道。

因此，為進(jìn)一步深入研究雌激素替代治療對(duì)大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的作用，本研究采用卵巢切除的中老年雌性大鼠為模型，以模擬女性絕經(jīng)后低雌激素水平的生理狀態(tài)［21］，給予雌激素替代治療，并結(jié)合體視學(xué)原理及電子顯微鏡技術(shù)研究雌激素替代治療對(duì)卵巢切除后中老年大鼠大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的影響。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

19只中老年（10－12月齡）雌性SD大鼠，體質(zhì)量（322±11）g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，光照時(shí)間為12h/d，室溫（22±2）℃。連續(xù)六天的陰道涂片提示所有動(dòng)物都處于不規(guī)律的動(dòng)情周期或持續(xù)性的動(dòng)情間期。

2.卵巢切除術(shù)及雌激素替代治療

大鼠在手術(shù)進(jìn)行前均禁食12h，1%的戊巴比妥鈉（0.4ml/100g體重）腹腔麻醉，行背部肋下切口，俯臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，對(duì)手術(shù)部位備皮，常規(guī)消毒，切開皮膚、肌肉，摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合傷口。術(shù)后給予連續(xù)3d右后腿肌注青霉素（8萬單位/每只）以預(yù)防感染。術(shù)后第3w，連續(xù)6d觀察大鼠陰道涂片，所有大鼠均處于動(dòng)情間期。取大鼠尾尖血測(cè)血清雌激素水平及處死后尸檢以再次判斷卵巢切除是否完全。術(shù)后1m，10只大鼠（OVX＋E組）給予持續(xù)1m的17β－estradiol（abcam ab120657）頸背部皮下注射（17β－estradiol溶于無水乙醇，用芝麻油稀釋至0.1g/ml，無水乙醇∶芝麻油為1∶149，皮下注射劑量為0.0025ml/g體質(zhì)量［22］，每天9：00a.m.注射）。其余9只大鼠（OVX＋Veh組）給予持續(xù)1m的芝麻油頸背部皮下注射（芝麻油內(nèi)混有無水乙醇，無水乙醇∶芝麻油為1∶149，劑量為0.0025ml/g體質(zhì)量，每天9：00a.m.注射）。

3.血清雌激素水平測(cè)定

為確保卵巢徹底切除及雌激素替代治療的有效性，對(duì)卵巢切除術(shù)后第3w末及雌激素替代治療后兩個(gè)階段所采的血進(jìn)行血清雌激素水平測(cè)定，使用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清雌激素水平（儀器為UniCel DxI 800Immunoassay System from Beckman Coulter），該檢測(cè)由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室完成。

4.水迷宮測(cè)試

采用DMS22型電腦全自動(dòng)程控Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。水迷宮直徑為150 cm，高為50cm，A、B、C、D 4個(gè)入水點(diǎn)將圓桶等分為4個(gè)象限。將有機(jī)玻璃制圓柱型平臺(tái)（直徑9.5 cm，高28.5cm）隨機(jī)放入某一象限的中間。水用墨汁染黑，水溫控制在23℃左右，實(shí)驗(yàn)時(shí)保持周圍環(huán)境的安靜。每組大鼠均用Morris水迷宮進(jìn)行連續(xù)6d的空間學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試。前5d為隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，水面高于平臺(tái)1－2cm，每個(gè)入水點(diǎn)均要測(cè)試1次，入水點(diǎn)順序隨機(jī)選擇，先把動(dòng)物置于平臺(tái)上15s，讓其熟悉周圍環(huán)境，動(dòng)物入水時(shí)面向池壁，輕放入水。記錄動(dòng)物的尋臺(tái)時(shí)間（從入水到找到平臺(tái)且四肢爬上平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期）。若入水180s仍未找到水池中的平臺(tái)，可將其置于平臺(tái)上15s，并且記錄尋臺(tái)時(shí)間為180s。若動(dòng)物爬上平臺(tái)未停留15s又入水游泳則繼續(xù)計(jì)時(shí)，直到其爬上平臺(tái)停留15s或游泳時(shí)間超過180s。一個(gè)入水點(diǎn)測(cè)試結(jié)束，從平臺(tái)上取下休息60s后再進(jìn)行下一個(gè)入水點(diǎn)的測(cè)試。測(cè)試環(huán)境及平臺(tái)位置相對(duì)不變。第6日為可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，重新選擇一個(gè)象限放置平臺(tái)，平臺(tái)高出水面1－2cm。僅選擇兩個(gè)遠(yuǎn)離平臺(tái)的入水點(diǎn)測(cè)試，其他過程同隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。

5.標(biāo)本固定與取材

水迷宮后，每組大鼠隨機(jī)選取5只，對(duì)大鼠進(jìn)行1%的戊巴比妥鈉（0.4ml/100g體質(zhì)量）腹腔麻醉，2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液（pH＝7.4）心灌流固定，去除小腦、腦干，將大腦完整取出。

6.白質(zhì)體積的測(cè)量

將左、右大腦半球分別沿冠狀線切成l mm的連續(xù)等距切片，在每張大腦切片的枕面隨機(jī)疊加透明的等距測(cè)點(diǎn)框，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)所有落在白質(zhì)上的測(cè)點(diǎn)數(shù)（圖1），根據(jù)卡瓦列里原理［23，24］計(jì)算出整個(gè)大腦白質(zhì)的總體積V（wm）。

圖1 計(jì)數(shù)落在白質(zhì)上的點(diǎn)數(shù)的方法（解剖顯微鏡×10）Fig.1 An illustration of the method to count the number of the points hitting the white matter（anatomy microscope，×10）.

7.電鏡標(biāo)本的制作

每只大鼠大腦隨機(jī)抽取一側(cè)半球，在這些半球中，每隔2張切片抽取1張，第1張切片在前3張中隨機(jī)確定。在抽取出的大腦組織薄片上隨機(jī)疊放等距測(cè)點(diǎn)框，在測(cè)點(diǎn)擊中白質(zhì)的地方抽取白質(zhì)組織塊，保證白質(zhì)的各個(gè)部位都有相同的抽中機(jī)率［23］，每個(gè)大腦半球抽取5個(gè)白質(zhì)組織塊。抽取出的白質(zhì)組織塊用4%戊二醛在4℃條件下浸泡固定2h，用0.1 mol/L PBS（pH＝7.2）沖洗3次，在1%鋨酸（Os04）中固定l h。脫水、浸透、醋酸雙氧鈾染色。先用球切法（isector）［23］包埋組織塊以保證各個(gè)方向分布的神經(jīng)纖維都有相同的抽樣概率，再用常規(guī)電鏡包埋法包埋白質(zhì)組織塊。從每個(gè)包埋好的組織塊上隨機(jī)切取1張60nm的超薄切片，每張切片上隨機(jī)選擇8個(gè)視野放大6000倍照相。

8.白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的體視學(xué)定量分析

8.1 有髓神經(jīng)纖維的長度密度和總長度：在6000倍放大的電鏡照片上隨機(jī)疊加無偏計(jì)數(shù)框，依據(jù)無偏計(jì)數(shù)框的計(jì)數(shù)原則（禁線原則）計(jì)數(shù)有髓神經(jīng)纖維斷面數(shù)［25］（圖2），按公式［23，24］計(jì)算白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的長度密度［Lv（nf/wm）］和白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總長度L（nf，wm）。

8.2 有髓神經(jīng)纖維的體積密度和總體積：在6000倍放大的電鏡照片上隨機(jī)疊加計(jì)數(shù)點(diǎn)，計(jì)數(shù)落在有髓神經(jīng)纖維上的測(cè)點(diǎn)數(shù)，以及落在整個(gè)照片內(nèi)的白質(zhì)的測(cè)點(diǎn)數(shù)［23］（圖3），按公式［23，24］計(jì)算白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的體積密度Vv（nf/wm）和白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的總體積V（nf，wm）。

8.3 髓鞘的體積密度和總體積：在6000倍放大的電鏡照片上隨機(jī)疊加計(jì)數(shù)點(diǎn)，計(jì)數(shù)落在有髓神經(jīng)纖維髓鞘上的計(jì)數(shù)點(diǎn)數(shù)以及落在整個(gè)照片內(nèi)的白質(zhì)上的計(jì)數(shù)點(diǎn)數(shù)［23］（圖3），按公式［23，24］計(jì)算白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的髓鞘體積密度Vv（ms）和髓鞘的總體積 V（ms，wm）。

圖2 計(jì)數(shù)白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維斷面的方法（透射電鏡×6000）Fig.2 An illustration of the method to count the number of the myelinated fiber profiles in the white matter（Transmission electron microscope，×6，000）.

圖3 計(jì)數(shù)落在白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維斷面上和髓鞘上測(cè)點(diǎn)數(shù)的方法（透射電鏡×6000）Fig.3 An illustration of the method to count the number of the points hitting the myelinated fibers and myelin sheaths in the white matter（Transmission electron microscope，×6，000）.

8.4有髓神經(jīng)纖維的平均直徑：測(cè)量所有被無偏計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)的有髓神經(jīng)纖維斷面的直徑。首先確定有髓神經(jīng)纖維斷面的最長軸，與該最長軸相垂直的所有橫軸中最長的一條為其直徑［11］。測(cè)量所有被無偏計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)的有髓神經(jīng)纖維斷面的直徑，并將直徑按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μm及1.8μm以上計(jì)數(shù)不同直徑等級(jí)下的纖維斷面數(shù)，然后除以總纖維斷面數(shù)，得出每一纖維直徑等級(jí)的纖維在總纖維中所占的比例，再乘以有髓神經(jīng)纖維總長度，就得出了每一纖維直徑等級(jí)的纖維長度的分布狀況。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)過正態(tài)分布檢驗(yàn)后對(duì)隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將OVX＋E組和OVX＋Veh組大鼠的大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維各統(tǒng)計(jì)參數(shù)經(jīng)過正態(tài)分布檢驗(yàn)后用student－t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有顯著意義。組內(nèi)的變異由變異系數(shù)CV（coefficient of variation）（CV＝SD/Mean）評(píng)估。各大腦間有髓神經(jīng)纖維總體積及總長度的生物學(xué)變異CVbio（biologic coefficient of variation），可通過體視學(xué)抽樣變異（觀察誤差系數(shù)，observed coefficient of error，OCE）和觀察腦間變異系數(shù)（observed inter－brain coefficient of variation，OCV），運(yùn)用公式OCV2＝ CV2bio＋ OCE2［26］得到。OCE可通過每個(gè)腦的誤差系數(shù)（coefficient of error，CE）獲得，按公式計(jì) 算［27］。由卡瓦列里原理得出的每一個(gè)大腦白質(zhì)體積的CE［V（wm）］可根據(jù) Gundersen et al.（1999）［28］給出的公式計(jì)算。由于有髓神經(jīng)纖維的長度密度、體積密度以及髓鞘的體積密度為比率估計(jì)量，它們的CE可按照Kroustrup和Gundersen［26］給出的公式計(jì)算。白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總體積和總長度的CE值通過Tang和 Nyengaard［23］給出的公式計(jì)算。

結(jié) 果

1.雌激素水平測(cè)定

卵巢切除術(shù)后大鼠血清雌激素水平為（10.60±4.95）pg/ml。給予雌激素替代治療后，OVX＋E組血清雌激素水平維持在（150.56±25.47）pg/ml，安慰劑治療的OVX＋Veh組雌激素水平為（18.33±4.39）pg/ml。

2.水迷宮測(cè)試結(jié)果

前5d的隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，OVX＋E組大鼠每天的潛伏期明顯短于OVX＋Veh組（P＝0.003，圖4），而在可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，兩組大鼠的潛伏期之間沒有區(qū)別（P＝0.170，圖4）。

圖4 OVX＋Veh組與OVX＋E組大鼠水迷宮潛伏期的比較Fig.4 Mean escape latencies of OVX＋Veh rats and OVX＋E rats from day 1to 6（Mean±SEM）are shown.a indicats the latencies of OVX＋E rats significantly shorter than those of OVX＋Veh rats（P＜0.05）.

3.體視學(xué)結(jié)果

大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的體視學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以及CE值的計(jì)算結(jié)果見表1，白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維直徑分布圖見圖5。大鼠大腦白質(zhì)及有髓神經(jīng)纖維的體視學(xué)研究結(jié)果顯示，OVX＋Veh組與OVX＋E組大鼠的大腦白質(zhì)總體積、白質(zhì)內(nèi)的有髓神經(jīng)纖維的長度密度、總長度和體積密度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑以及髓鞘的體積密度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。主要體視學(xué)測(cè)量結(jié)果的體視學(xué)抽樣變異小于15%，生物學(xué)變異（CVbio）占觀察總變異（OCV）的75%左右。

圖5 OVX＋veh組大鼠與OVX＋E組大鼠有髓神經(jīng)纖維平均直徑分布的比較Fig.5 Comparisons of the myelinated fiber length with different diameters in the white matter between OVX＋Veh rats and OVX＋E rats.

表1 2組大鼠大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的體視學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table1 Stereological results of the white matter and the myelinated fibers in the white matter of the two groups

討 論

有大量的臨床研究報(bào)道ERT可改善絕經(jīng)后女性的認(rèn)知功能［3］，并且這一結(jié)論在靈長類動(dòng)物模型及嚙齒類動(dòng)物模型的研究中也得到了驗(yàn)證［4，5］。本研究中，經(jīng)過1個(gè)月的ERT后，運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間記憶能力，OVX＋E組的大鼠的空間記憶能力明顯優(yōu)于OVX＋Veh組大鼠，這與既往的一些研究結(jié)果是一致的［29，30］。但是包括WHI（Women’s Health Initiative Memory Study）在內(nèi)的諸多臨床調(diào)查研究并沒有證實(shí)ERT對(duì)絕經(jīng)后女性認(rèn)知功能的積極作用［31］。Sherwin在對(duì)既往臨床的調(diào)查研究回顧中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致ERT對(duì)絕經(jīng)后女性認(rèn)知功能作用差異的關(guān)鍵原因在于ERT開始的時(shí)間不同，絕經(jīng)后早期階段就開始ERT的女性認(rèn)知功能得到了改善，而在絕經(jīng)后多年才開始ERT的女性則沒有表現(xiàn)出認(rèn)知功能的改善［3］。這種ERT對(duì)認(rèn)知功能作用的時(shí)間窗假說在動(dòng)物模型和臨床研究中也得到了證實(shí)［32，33］。Sherwin等的綜述中總結(jié)到雌激素替代治療對(duì)女性認(rèn)知的保護(hù)作用只體現(xiàn)在年輕女性和中老年女性，而在老年女性則可能對(duì)認(rèn)知造成損害，中老年女性ERT的關(guān)鍵時(shí)期為50－59歲［32］。Bohacek等的研究提出中老年雌性SD大鼠卵巢切除模型ERT的關(guān)鍵時(shí)期為卵巢切除術(shù)后5個(gè)月內(nèi)［33］。本實(shí)驗(yàn)研究中，ERT開始于OVX術(shù)后一個(gè)月，在中老年卵巢切除大鼠ERT的關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)，Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明了ERT對(duì)認(rèn)知功能的改善作用。

由此看來，在絕經(jīng)后早期或OVX后短期內(nèi)進(jìn)行ERT對(duì)認(rèn)知功能有積極的作用?；诖竽X白質(zhì)在大腦認(rèn)知功能中的重要地位，ERT對(duì)大腦白質(zhì)的作用如何呢？運(yùn)用核磁共振成像（MRI）技術(shù)，Ha等［16］發(fā)現(xiàn)長期的ERT可以減少白質(zhì)的老年性丟失，Liu等［17］報(bào)道長期低劑量的ERT可減少絕經(jīng)后女性大腦白質(zhì)的高信號(hào)灶。但同樣運(yùn)用MRI技術(shù)測(cè)量大腦白質(zhì)信號(hào)，Low 等［18］和 Greenberg等［19］的研究發(fā)現(xiàn)ERT對(duì)絕經(jīng)后女性的大腦白質(zhì)體積沒有顯著影響，Luoto等［20］的研究甚至表明ERT不僅不能減少絕經(jīng)后女性大腦白質(zhì)病變，反而會(huì)加重大腦萎縮。既往關(guān)于ERT對(duì)大腦白質(zhì)體積作用的研究均為影像學(xué)研究［16－20］，雖然影像學(xué)手段可以直接獲取活體的整個(gè)大腦的白質(zhì)信息，但是，影像學(xué)信息是間接的，且影響因素復(fù)雜。在影像學(xué)圖像上，要清楚地劃出白質(zhì)的邊界也不是非常容易。本研究基于現(xiàn)代體視學(xué)方法的基本原理，實(shí)現(xiàn)了三維空間內(nèi)的精確定量。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，為期1m的ERT對(duì)中老年卵巢切除大鼠的大腦白質(zhì)的體積并沒有顯著性的影響。這個(gè)結(jié)果雖然與Low等［18］和Greenberg等［19］的結(jié)論相一致，但是本研究結(jié)果并不能否認(rèn)ERT對(duì)中老年大腦白質(zhì)的積極作用。總結(jié)過去ERT對(duì)大腦白質(zhì)體積作用的研究，不難發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致結(jié)論不一的因素除了定量方法的局限外，也可能存在ERT治療時(shí)間窗的影響。在Ha等的研究中受試對(duì)象為平均絕經(jīng)時(shí)間25.4年的婦女，接受ERT的持續(xù)時(shí)間平均為23.1年，可以說，受試對(duì)象基本在絕經(jīng)后短期內(nèi)即開始了ERT［16］，結(jié)論為ERT可以減少大腦白質(zhì)的老年性丟失。而在Greenberg等［19］和 Luoto［20］等的研究中，受試對(duì)象的平均年齡分別為70歲、74.8歲，而她們的絕經(jīng)年限不詳，ERT開始時(shí)間的年齡分布較廣，且ERT開始時(shí)間與絕經(jīng)期的關(guān)系不詳，他們得出ERT對(duì)絕經(jīng)后女性大腦白質(zhì)體積沒有影響的結(jié)論也是可以接受的。在本實(shí)驗(yàn)研究中，ERT開始于OVX術(shù)后1m，可以排除雌激素治療時(shí)間窗假說的干擾，得出此結(jié)論，有一個(gè)關(guān)鍵因素為ERT持續(xù)的時(shí)間。在Ha等［16］的研究中，ERT持續(xù)時(shí)間平均為23.1y，相當(dāng)于壽命的四分之一，而在本實(shí)驗(yàn)中，僅為期1m的ERT，因此，并不能否認(rèn)長期ERT可以保護(hù)老年大腦白質(zhì)。

有髓神經(jīng)纖維為大腦白質(zhì)中的主要成分，正常老年大腦白質(zhì)存在有髓神經(jīng)纖維的顯著性丟失［11］。有髓神經(jīng)纖維參與神經(jīng)沖動(dòng)的跳躍式傳導(dǎo)，脫髓鞘改變的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度下降也許是老年大腦認(rèn)知功能降低的重要原因之一［34］。本團(tuán)隊(duì)早期研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠大腦白質(zhì)的老年性改變?cè)缬诖菩裕?8 m雄性大鼠白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總長度下降的程度遠(yuǎn)大于雌性［35］。18m 雌性大鼠剛進(jìn)入老年期［36］，體內(nèi)雌激素水平還沒有顯著下降，可能是雌激素對(duì)髓鞘的保護(hù)作用使18m雌性大鼠白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總長度較年輕大鼠沒有顯著性下降［35］。Crawford等在對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型研究中發(fā)現(xiàn)，給予雌激素受體β的配體替代治療后，即使在炎癥存在的情況下，胼胝體內(nèi)軸突的結(jié)構(gòu)和功能均得到保護(hù)，并且出現(xiàn)髓鞘再生［37］。Patel等的研究發(fā)現(xiàn)，雙環(huán)己酮草酰二腙誘導(dǎo)脫髓鞘的卵巢切除小鼠接受雌激素替代治療后，可促進(jìn)其胼胝體內(nèi)正常的髓鞘形成、減少脫髓鞘，并且可以促進(jìn)髓鞘再生［38］。因此，我們推測(cè)雌激素可能通過防止有髓神經(jīng)纖維脫髓鞘來保護(hù)大腦白質(zhì)的老年性皺縮。本研究基于體視學(xué)原理，結(jié)合透射電鏡技術(shù)，在細(xì)胞水平和超微結(jié)構(gòu)水平定量研究ERT對(duì)大腦有髓神經(jīng)纖維的影響。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，為期1m的ERT對(duì)中老年OVX大鼠的大腦白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的總體積、總長度、平均直徑及髓鞘的總體積均沒有顯著性的影響。但該結(jié)論與其他學(xué)者研究的結(jié)果并不完全矛盾。在本團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，中老年雌性大鼠（18m）的白質(zhì)體積較年輕雌性大鼠（6－8m）并沒有顯著性的丟失，而其白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維和髓鞘的體積反而較年輕雌性大鼠明顯增加［35］。因此在本研究中，10－12m的中老年大鼠經(jīng)歷一個(gè)月的術(shù)后休息期和一個(gè)月的ERT，大腦白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維在僅僅兩個(gè)月內(nèi)可能并沒有發(fā)生顯著地老年性改變，導(dǎo)致短期的ERT對(duì)大腦白質(zhì)體積及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的作用均不顯著。

本實(shí)驗(yàn)中主要體視學(xué)測(cè)量結(jié)果的體視學(xué)抽樣變異小于15%，生物學(xué)變異（CVbio）占觀察總變異（OCV）的75%左右，這說明體視學(xué)抽樣變異僅占觀察總變異的一小部分（表1）。因此，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各階段抽樣的樣本量是足夠的，不需要再對(duì)本設(shè)計(jì)的抽樣方案進(jìn)行進(jìn)一步的分析和優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)中老年卵巢切除大鼠給予一個(gè)月ERT，一個(gè)月的ERT相對(duì)較短，這是本實(shí)驗(yàn)的局限性。為明確ERT對(duì)中老年大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的影響，下一步需要進(jìn)一步研究長期ERT對(duì)中老年大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的作用。

綜上所述，為期1m的ERT可以改善中老年卵巢切除大鼠的空間記憶能力，但是對(duì)中老年卵巢切除大鼠大腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維并沒有顯著性的影響。本研究運(yùn)用的方法可為將來運(yùn)用該模型研究ERT對(duì)正常老年大腦白質(zhì)及神經(jīng)退行性疾病狀態(tài)下大腦白質(zhì)的作用提供可靠、有效的研究手段。

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