唐婕，劉二龍，盧麗，李斐然，王永奇，劉文華*

(1.陜西省動物研究所，陜西 西安 710032；2.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510730)

林麝源化膿隱秘桿菌LAMP快速檢測方法的建立

唐婕1，劉二龍2，盧麗2，李斐然1，王永奇1，劉文華1*

(1.陜西省動物研究所，陜西 西安 710032；2.廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510730)

根據(jù)GenBank已公布的化膿隱秘桿菌溶血素((Pyolysin，PLO)基因設(shè)計6條引物，建立一種靈敏的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)用于化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)的快速檢測，并對檢測方法的特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。對化膿隱秘桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、非O1霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單孢菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌等9株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行的特異性試驗(yàn)表明，建立的LAMP方法僅對化膿隱秘桿菌的檢測結(jié)果為陽性；該方法的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)112 fg。采用本研究建立的方法檢測20份林麝臨床病例樣品，共鑒定出10株化膿隱秘桿菌，與API Coryne生化鑒定方法的符合率為100%。

林麝；化膿隱秘桿菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)

化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)為多形性、無運(yùn)動性的革蘭氏陽性桿菌，曾被稱為化膿棒狀桿菌、化膿放線菌。Ramos等根據(jù)16S rRNA 基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析后，將化膿隱秘桿菌分類到隱秘桿菌屬[1–2]。化膿隱秘桿菌常寄生于上呼吸道、消化道等的黏膜處，是一種條件性致病菌，能引起多種動物，如豬、牛、羊、禽和人類的多種器官、黏膜的化膿性感染，出現(xiàn)肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、外耳炎、膀胱炎及肝臟、腎臟膿腫等癥狀[3–5]。筆者發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌感染林麝可引起其頜下、鼻鏡等處的膿腫，且與大腸桿菌、鏈球菌等混合存在，使感染加重，導(dǎo)致林麝的死亡[6–7]?；撾[秘桿菌毒力因子主要有溶血素(Pyolysin，PLO)、神經(jīng)氨酸酶(Nan)、膠原結(jié)合蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim)，其最主要的致病因子是細(xì)胞外毒素PLO[8]。1997年，Billington 等[9]從野生型化膿隱秘桿菌BBR1中克隆測序了plo全基因。

目前，化膿隱秘桿菌診斷主要采用細(xì)菌分離培養(yǎng)，但該菌生長速度慢，需要36～48 h才能長出菌落，并且對于菌落形態(tài)的判斷要求實(shí)驗(yàn)人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，還需通過系列的生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，費(fèi)時費(fèi)力，延誤治療時機(jī)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除傳統(tǒng)檢測方法外，還有一些快速的檢測方法，如免疫學(xué)方法和PCR等。免疫學(xué)方法雖然簡單，但靈敏度不理想；PCR方法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，但檢測成本較高，儀器昂貴，擴(kuò)增反應(yīng)時間較長，并且對實(shí)驗(yàn)人員具有較高的要求[2,4,10]。此外，臨床上A．pyogenes感染的病例大多為復(fù)合性感染，常因?yàn)椴荒芸焖贆z測出該致病菌，無法采取有針對性的治療措施。

本試驗(yàn)擬根據(jù)A. pyogenes的plo基因序列，建立適用于臨床樣品化膿隱秘桿菌檢測的特異性強(qiáng)、靈敏度高的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)可視化檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

鼠傷寒沙門氏菌(CMCC(B)50115)；非O1霍亂弧菌(VbO)；單增李斯特氏菌(ATCC 15313)；表皮葡萄球菌(CMCC 26069)；金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)；嗜水氣單孢菌(ATCC 7966)；副溶血性弧菌(ATCC 17802)；蠟樣芽孢桿菌(ATCC 11778)。以上菌株均購自陸橋生物技術(shù)公司?；撾[秘桿菌由筆者從陜西省養(yǎng)殖場林麝患膿腫部位分離純化，并經(jīng)API Coryne鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：血瓊脂平板(北京陸橋公司)；腦心浸淬液(BHI)(北京陸橋公司)；wizard 基因組提取試劑(promega公司)；Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs公司)；甜菜堿(Betaine)、MgCl2(Sigma公司)；dNTPs(寶生物工程(大連)有限公司)；SYTO–9熒光染料(Invitrogen公司)；100 bp Ladder DNA Marker(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

主要儀器：CT15RE高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)；ND2000C微量分光光度計(Thermo Scientific)；S1000PCR儀(BIO–RAD)；tanon 4200凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；通用型電泳儀(BIO–RAD)；API Coryne鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃公司)。

1.2 方 法

1.2.1 LAMP方法的建立

1) 模板DNA的制備。將化膿隱秘桿菌接種于新鮮BHI培養(yǎng)基中，37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)48 h。取1 mL菌液，離心取上清，采用wizard基因組DNA試劑盒提取DNA，作為LAMP反應(yīng)的模板。

2) 引物的設(shè)計與合成。根據(jù)GenBank上化膿隱秘桿菌plo基因序列(登錄號為U84782)，用Primer Exploer V4引物設(shè)計軟件設(shè)計一套特異性的LAMP引物，包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP(F1c+F2)、BIP (B1c+B2)、以及環(huán)引物L(fēng)oop F、Loop B共六條，引物堿基序列見表1。引物委托英濰捷基公司合成。

3) LAMP。反應(yīng)體系(25 μL)：10×Thermopol Buffer 2.5 μL、5 μmol/L F3和B3各1 μL、40 μmol/L FIP和BIP各1 μL、20 μmol/L FLP和BLP各1 μL、10 mmol/L dNTPs 4 μL、5 mol/L甜菜堿5 μL、100 mmol/LMgSO41 μL、8 U/μL Bst DNA polymerase 1 μL、模板DNA 2 μL(空白對照以2 μL ddH2O代替模板DNA)、ddH2O 3.5 μL。選取溫度60、63、65 ℃，時間40、60、80 min進(jìn)行LAMP 反應(yīng)擴(kuò)增。采用SYTO–9指示劑，陽性反應(yīng)為黃綠色，陰性反應(yīng)為棕褐色。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。確立最優(yōu)反應(yīng)溫度和時間后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 擴(kuò)增plo基因的LAMP引物Table 1 LAMP primer sets for specific amplification of plo gene

1.2.2 LAMP方法特異性試驗(yàn)

分別用化膿隱秘桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、非O1霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單孢菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌相應(yīng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度增菌培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液以12 000 r/min離心3 min，棄上清，加ddH2O 100 μL重懸，96 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清2 μL，作為DNA模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性。

1.2.3 LAMP 方法靈敏度試驗(yàn)

于血瓊脂平板上挑取單個化膿隱秘桿菌接種于新鮮的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)48 h。取1 mL菌液，離心取上清，采用wizard基因組DNA試劑盒提取DNA，經(jīng)微量分光光度計測得濃度后，對DNA進(jìn)行10倍稀釋，用于化膿隱秘桿菌的LAMP檢測體系的靈敏度試驗(yàn)。

1.2.4 臨床樣品檢測

從陜西省養(yǎng)殖場無菌采集20份林麝患膿腫部位的膿液，置冰盒內(nèi)低溫運(yùn)至陜西省動物研究所實(shí)驗(yàn)室。將采集的20份病料分別涂布接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取圓形、光滑、表面突起、β–溶血的灰白色菌落接種BHI，37 ℃培養(yǎng)24 h，按1.2.4中方法制備模板，進(jìn)行LAMP檢測。BHI菌液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用API Coryne鑒定系統(tǒng)對細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，具體操作按說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

以化膿隱秘桿菌為模板，用不同溫度和時間進(jìn)行LAMP。結(jié)果：63 ℃恒溫反應(yīng)60 min的樣品呈黃綠色(圖1)，且能檢測出梯度電泳條帶(圖2)。

圖1 LAMP反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Results of LAMP

圖2 LAMP產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果Fig.2 Electrophoresis for LAMP products

2.2 LAMP 方法的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，僅化膿隱秘桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物顯黃綠色。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果(圖4)顯示，僅化膿隱秘桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)梯度條帶，表明LAMP 檢測方法具有良好的特異性。

圖3 不同細(xì)菌樣品的LAMP反應(yīng)結(jié)果Fig.3 Results of LAMP on different bacterial samples

圖4 不同細(xì)菌樣品LAMP產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis for LAMP products from different bacterial samples

2.3 LAMP 方法的靈敏度

測得化膿隱秘桿菌初始模板濃度為56 ng/μL。對經(jīng)10倍梯度稀釋的模板進(jìn)行檢測。10–2～10–6的稀釋度模板(112×10–9～112×10–15g的模板DNA)的擴(kuò)增產(chǎn)物均呈現(xiàn)黃綠色(圖5)，電泳檢測發(fā)現(xiàn)均有特異性的電泳梯狀條帶(圖6)。即該LAMP體系可以檢測到112 fg的化膿隱秘桿菌DNA。

圖5 化膿隱秘桿菌稀釋樣品的LAMP檢測結(jié)果Fig.5 Results of LAMP for diluted A. pyogenes

圖6 化膿隱秘桿菌稀釋樣品的LAMP產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis for LAMP products from diluted A. pyogenes

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

用LAMP對采集的20份病料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)10份樣品中含有化膿隱秘桿菌。采用API Coryne鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果10份病料中分離的菌株經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定為化膿隱秘桿菌。LAMP方法對20份采集的病料樣品進(jìn)行檢測的結(jié)果與API鑒定檢測結(jié)果一致，符合率100%。

3 討 論

本研究建立了一種針對化膿隱秘桿菌的LAMP快速檢測方法，較其他的分子生物學(xué)技術(shù)有以下優(yōu)勢：根據(jù)目的基因序列設(shè)計6條引物，對靶序列的8個特異序列的識別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性，采用本方法對單增李斯特氏菌等8種菌的檢測結(jié)果均為陰性；核酸提取可簡化為適量菌液煮沸后，取2 μL上清，當(dāng)作反應(yīng)模板，在等溫(63 ℃)條件下反應(yīng)1h，即可完成整個LAMP反應(yīng)，操作簡便易行；特異性的引物設(shè)計使得引物介導(dǎo)的鏈延伸，循環(huán)過程形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，本研究建立的化膿隱秘桿菌LAMP方法靈敏度在DNA水平上可達(dá)到112 fg；在添加了熒光染料后，陽性擴(kuò)增管呈現(xiàn)黃綠色，陰性管無變化，可以直接用肉眼判定有無擴(kuò)增產(chǎn)物，無須電泳分析或購置濁度儀，在臨床檢測的應(yīng)用中具有較大的優(yōu)勢。

應(yīng)用該LAMP方法對20份臨床病料的檢測，其結(jié)果與API生化鑒定方法的結(jié)果一致，表明該方法可明顯縮短化膿隱秘桿菌引起的膿腫病的確診時間。LAMP技術(shù)快速、簡便，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求不高，因此，本研究建立的化膿隱秘桿菌的LAMP方法適合在技術(shù)條件相對落后的基層實(shí)驗(yàn)室、獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場使用。

[1] Ramos C P，F(xiàn)oster G，Collins M D．Phylogenetic analysis of the genus Actinomyces based on 16S rRNA gene sequences：Description of Arcanobacterium phocae sp. nov.，Arcanobacterium bernardiae comb．nov．，and Arcanobacterium pyogenes comb. nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiogy，1997，47(1)：46–53．

[2] 王密，周玉龍，樸范澤．?；撔噪[秘桿菌病PCR診斷方法的建立[J]．微生物學(xué)通報，2010，37(9)：1320–1324．

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection of forest musk deer Arcanobacterium pyogenes

TANG Jie1, LIU Er-long2, LU Li2, LI Fei-ran1,WANG Yong-qi1, LIU Wen-hua1*
(1.Shaanxi Institute of Zoology, Xi’an 710032, China; 2.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510730, China)

According to Arcanobacterium pyogenes plo gene sequences published on GenBank, six specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers were designed to establish a method of LAMP for detection of Arcanobacterium pyogenes from forest musk deer and the specificity and sensitivity of this method were assayed. The specific test results showed that positive results obtained only from Arcanobacterium pyogenes while the amplified results of 8 non-Arcanobacterium pyogenes strains including Salmonella typhimurium, non-O1 Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Vibrio parahemolyticus and Bacillus cereus were negative. The detection sensitivity of the LAMP assay for Arcanobacterium pyogenes was 112 fg pure genomic DNA per 25 μL reaction. The test based on the method of this essay were applied on 20 clinical samples, 10 clinical samples were positive which were in accord with API coryne identification.

forest musk deer; Arcanobacterium pyogenes; loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

S865.4+1；S855.1+2

A

1007?1032(2014)03?0316?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.018

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–01–02

陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)專項(xiàng)(2013K–12)

唐婕(1981—)，女，湖南攸縣人，博士研究生，助理研究員，主要從事野生動物疾病防治研究，yaya184@126.com；*通信作者，LWH8506@163.com