肖玉明，盧曉鵬，黃成能，熊江，李靜，謝深喜*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128)

水分脅迫對溫州蜜柑果實品質(zhì)及檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肖玉明1,2，盧曉鵬1,2，黃成能1,2，熊江1,2，李靜1,2，謝深喜1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128)

以5年生盆栽枳砧‘山下紅’溫州蜜柑為試材，于2012年7月5日至11月15日進(jìn)行控水試驗，以正常澆水為對照，研究40%土壤水分脅迫處理對溫州蜜柑果實品質(zhì)及檸檬酸代謝過程中3個相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：處理組成熟果實單果重、果皮重、橫徑與縱徑分別比對照組減小了59.0%、61.7%、25.2%和21.7%，與對照組間的差異均達(dá)極顯著水平；處理組果實中果汁與維生素C含量減少，而可溶性固形物含量增加；處理組果肉中的蔗糖、葡萄糖、果糖與總糖含量較對照分別增加了33.3%、72.3%、65.0%和48.9%，而單果蔗糖、葡萄糖、果糖與總糖含量分別減少了42.1%、25.1%、28.3%和37.8%；處理組果肉中的檸檬酸和總有機(jī)酸含量分別比對照組高66.3%和60.4%，單果檸檬酸和有機(jī)酸含量比對照組高11.3%和50.6%，與對照間的差異均達(dá)極顯著水平；基因表達(dá)結(jié)果顯示，在水分脅迫下，CitCS的表達(dá)量增加，而CitIDH的表達(dá)量減少，CitACO表達(dá)量在果實發(fā)育后期有一定的增加?？傮w而言，水分脅迫明顯抑制了溫州蜜柑果實生長，單果檸檬酸含量增加，而糖分含量減少，糖酸比下降，果實品質(zhì)下降。CitCS表達(dá)量增加及CitACO表達(dá)量下降可能是檸檬酸積累的原因之一。

柑橘；水分脅迫；果實；品質(zhì)；檸檬酸；基因表達(dá)量

柑橘果實在生長發(fā)育過程中需水量大，而中國南方的柑橘多種植在丘崗山地，其立地與灌溉條件較差，加之果實膨大的關(guān)鍵時期經(jīng)常遭遇夏秋季節(jié)性干旱，所以，柑橘旱害問題十分突出。干旱極易對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不可逆的不良影響[1–4]。目前，關(guān)于柑橘水分脅迫的研究多停留在柑橘的形態(tài)特征、生理生化及粗略品質(zhì)變化方面[5–8]，關(guān)于其果實中糖和有機(jī)酸變化的研究尚少。有機(jī)酸作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類生物小分子，可以為植物細(xì)胞提供質(zhì)子，從而啟動很多代謝反應(yīng)，與植物逆境生理密切相關(guān)[9]。檸檬酸和蘋果酸是植物體內(nèi)關(guān)鍵的代謝物，參與C4循環(huán)等眾多代謝途徑，可以顯著提高植物體的耐酸性和對鋁毒的抗性[10]。多數(shù)柑橘果實為檸檬酸積累型[11–12]。筆者對果實發(fā)育成熟階段的溫州蜜柑進(jìn)行水分脅迫，研究其果實品質(zhì)及檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，以期為應(yīng)對干旱措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

5年生枳砧‘山下紅’溫州蜜柑盆栽于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘改良中心長沙分中心溫室大棚內(nèi)。盆栽土壤為中心實驗室統(tǒng)一配用的基質(zhì)，由草碳、鋸木屑及細(xì)河沙按照一定比例混勻而成。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2012年3—12月在國家柑橘改良中心長沙分中心實驗室完成。由于長期處于土壤最大持水量20%的溫州蜜柑果實無法生長發(fā)育，而60%水分脅迫的效果不明顯，因此，以土壤最大持水量40%含水量為水分脅迫處理，以正常澆水(含水量大于土壤最大持水量60%)處理為對照。所有材料從3月開始統(tǒng)一進(jìn)行管理，待生理落果完成后，選取生長勢基本一致的橘樹， 于7月5日開始水分脅迫處理。處理當(dāng)天澆透水，之后每天測定土壤水分含量，當(dāng)土壤水分含量下降至40%后的2周內(nèi)繼續(xù)保持每天測定水分含量并適當(dāng)補(bǔ)水，之后改為每1周測1次水分含量，得出土壤水分含量維持在40%左右的操作規(guī)律：高溫夏秋季每2 d每盆補(bǔ)水約250 mL，低溫秋冬季每5 d每盆補(bǔ)水約250 mL；對照組根據(jù)大棚氣候條件每隔3～5 d澆透水1次。每個處理10株材料，3次重復(fù)。分別于處理后10、40、70、100、130 d采樣。每次采集果實10個，其中6個置于–40 ℃保存，用于測定果實品質(zhì)；4個經(jīng)液氮速凍后置于–80 ℃保存，用于檸檬酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量分析。

1.3 主要儀器設(shè)備與試劑

主要儀器設(shè)備有TDR 300 Soil Moisture Meter水分測定儀、ATAGO袖珍數(shù)字式白利度折光儀、pH測定儀、島津LC–20AT高效液相色譜儀、CFX96 Real–Time PCR Detection System定量PCR儀等。

TransZol Plant試劑盒購自TransGen Biotech公司；DNaseⅠ和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購自TAKARA和Bio–Rad公司。

主要試劑有果糖、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸與抗壞血酸標(biāo)樣、色譜純甲醇與乙腈、異丙醇、DEPC水、氯仿、乙醇等。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 果實品質(zhì)指標(biāo)測定

1) 果實質(zhì)量、大小、可食率及果汁含量的測定指標(biāo)包括單果重、果皮重、果實橫徑、縱徑、果皮厚度以及果汁體積，并計算出果實縱橫徑比和可食率。

2) 用ATAGO袖珍數(shù)字式白利度折光儀測定可溶性固形物含量；參照文獻(xiàn)[13]，采用碘量法測定維生素C含量。

3) 果肉主要糖酸含量HPLC分析。采用超純水浸提法提取樣品，設(shè)3次重復(fù)。每個處理選取5個新鮮果實，剝?nèi)スず笥脭囁闄C(jī)搗勻粉碎，然后稱取3 g，用15 mL超純水洗滌數(shù)次后轉(zhuǎn)至50 mL有蓋試管中，70 ℃水浴30 min，充分搖勻后再水浴15 min，待冷卻后過濾至25 mL容量瓶中，殘渣用超純水洗滌數(shù)次，濾液一并濾入容量瓶，定容后4 ℃短時間保存，用于測定果糖、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸的含量。①糖分含量測定條件：用示差檢測器測定，氨基柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津公司產(chǎn))、柱溫35 ℃、流動相(乙腈、超純水體積比為 0.75∶0.25)、總流速 1 mL/min，測定時間20 min，進(jìn)樣量20 μL。②有機(jī)酸含量測定條件：用紫外檢測器測定，檢測波長 210 nm、C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津公司產(chǎn))、柱溫17 ℃、流動相(甲醇、0.06 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液體積比為0.024∶0.576，緩沖液用磷酸調(diào)pH至2.5左右)，總流速0.6 mL/min，測定時間20 min，進(jìn)樣量8 μL。

1.4.2 基因表達(dá)分析

1) RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄。果肉總RNA的提取采用TransZol Plant試劑盒法。逆轉(zhuǎn)錄采用兩步法：先將RNA用DNaseⅠ進(jìn)行純化，再用iScript cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

2) 熒光定量PCR?；虮磉_(dá)采用相對熒光定量PCR進(jìn)行分析。選取與檸檬酸代謝密切相關(guān)的CitIDH (isocitrate dehydrogenase 1)、CitCS(citrate synthase 2) 和CitACO(3–isopropylmalate dehydratase protein) 3個酶基因[14](括號內(nèi)名稱代表該基因相應(yīng)的酶)，以Actin基因為內(nèi)參，基因序列通過已公布的克里曼丁橘單倍體基因組查得。引物設(shè)計采用Primer Express 3.0軟件，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，相對定量PCR引物序列見表1。

表1 相對定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences and length of real-time quantitative PCR

反應(yīng)體系10 μL，包括ddH2O 3.6 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，25 ng/μL模板0.6 μL，2×SuperMix酶5 μL(購自Bio–Rad公司)。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火10 s；72 ℃延伸15 s；40個循環(huán)；50 ℃保溫1 min；95 ℃保溫1 min。繪制引物溶解曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

分別采用Excel 2003和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用SPSS 19.0軟件的Pearson，分別對溫州蜜柑果實中CitCS, CitACO及CitIDH的相對表達(dá)量與果肉檸檬酸含量和單果檸檬酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對果實品質(zhì)的影響

2.1.1 對果實大小、果皮厚度、可食率與縱橫徑比的影響

由表2可見，水分脅迫條件下，柑橘單果重在處理100 d時顯著低于對照，處理70、130 d時極顯著低于對照；皮重在處理100 d時顯著低于對照，在130 d時極顯著低于對照；果實橫徑在處理40、70、100 d時顯著低于對照，130 d時極顯著低于對照；縱徑在處理70 d時顯著低于對照，100、130 d時極顯著低于對照；可食率在處理后10 d和130 d與對照間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；縱橫徑比在處理70 d時顯著低于對照；果皮厚度在處理10 d時顯著低于對照?？傮w而言，處理130 d時(果實成熟時)，處理組果實單果重、皮重、橫徑以及縱徑分別比對照減少了59.0%、61.7%、25.2%和21.7%，而果皮厚度、可食率以及縱橫徑比與對照間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明溫州蜜柑果實在40%土壤水分脅迫條件下能夠生長發(fā)育，但生長發(fā)育受到了明顯抑制，成熟果實單果重、皮重均顯著低于對照，橫徑及縱徑均小于對照，果實較對照小且輕。

2.1.2 對果實果汁、可溶性固形物與維生素 C含量的影響

由表2可見，水分脅迫條件下，柑橘果實維生素C含量在處理100 d時極顯著高于對照，在處理130 d時極顯著低于對照，70 d時與對照間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；果肉中的果汁含量在處理70、100、130 d時均較對照低，130 d時僅為對照組的83.0%；果實可溶性固形物含量在處理70、100、130 d時都比對照高，130 d時比對照高4.5%。綜合分析可知，40%水分脅迫條件下，溫州蜜柑果實中的果汁與維生素C能夠正常積累，但含量較對照有一定程度減少；可溶性固形物含量隨果實的成熟而升高，且含量比對照的高。

表2 不同處理時間柑橘果實的大小、鮮重、果皮厚度、可食率、縱橫徑比、果汁體積、可溶性固形物及維生素C含量Table 2 Fruit weight, size, peel thickness, flesh recovery, ratio of longitudinal diameter to transverse diameter (LD/TD), juice recovery, soluble solids and ascorbic acid content of citrus fruit in different treatment times

2.1.3 對果實糖含量的影響

2.1.3.1 對果肉中糖含量的影響

由表3可見，水分脅迫處理下，柑橘果實果肉中的果糖、葡萄糖與總糖含量在處理10、40、100、130 d時極顯著高于對照；果肉中的蔗糖含量在處理 40、100、130 d時極顯著高于對照，而在處理70 d時果肉中的3種糖及總糖含量與對照的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。總體而言，130 d時處理組果實果肉中的蔗糖、葡萄糖、果糖與總糖含量分別比對照增加了33.3%、72.3%、65.0%和48.9%，表明40%水分脅迫條件下溫州蜜柑果實中蔗糖、葡萄糖和果糖能夠正常積累，總糖含量升高，且果肉中的各糖分和總糖含量均明顯高于對照果實。

表3 不同處理時間柑橘果實的糖含量Table 3 Sugar content of citrus fruit in different treatment times

續(xù) 表

2.1.3.2 對單果糖含量的影響

由表3可見，水分脅迫條件下，柑橘果實中的單果果糖含量在處理40、70、100、130 d時極顯著低于對照；單果葡萄糖含量在處理 40、70、130 d時極顯著低于對照；單果蔗糖含量與單果總糖含量在處理后10 、40、70、100、130 d時均極顯著低于對照；130 d時處理組果實的單果蔗糖、葡萄糖、果糖與總糖含量分別較對照減少了42.1%、25.1%、28.3%和37.8%。綜合分析可知，40%水分脅迫條件下，溫州蜜柑果實果肉中的蔗糖、葡萄糖、果糖和總糖含量的變化趨勢與對照的變化趨勢一致，且含量隨果實的發(fā)育成熟而逐漸升高，但由于水分脅迫導(dǎo)致果實較對照小且輕，其果實的單果糖分含量顯著低于對照，表明水分脅迫下溫州蜜柑果實的果肉糖含量增加是由果實較對照小引起的。

（3）對向美國或其他外國市場出口的產(chǎn)品實行補(bǔ)貼（或有補(bǔ)貼效果的措施），從而實質(zhì)性影響了美國有競爭力的產(chǎn)品在美國市場或其他外國市場的銷售。

2.1.4 對柑橘果實有機(jī)酸含量的影響

2.1.4.1 對果肉有機(jī)酸含量的影響

表4結(jié)果表明，水分脅迫條件下，柑橘果實果肉中的總有機(jī)酸與檸檬酸含量在處理后 10 、40、70、100、130 d時均極顯著高于對照；果肉蘋果酸含量在處理40、70 d時極顯著高于對照；果肉奎寧酸含量在處理40、70 d時極顯著高于對照，而在處理10、100 d時極顯著低于對照；130 d時，處理組果實的果肉總有機(jī)酸和檸檬酸含量分別比對照高66.3%和60.4%。綜合分析可知，40%水分脅迫條件下，溫州蜜柑果實的果肉檸檬酸與總有機(jī)酸含量隨果實發(fā)育成熟有一定程度的下降，但下降幅度明顯小于對照果實，說明 40%水分脅迫導(dǎo)致了果實檸檬酸積累，總有機(jī)酸含量增加，而蘋果酸與奎寧酸僅在果實發(fā)育前期，即處理40、70 d時比對照高。

表4 不同處理時間柑橘果實的有機(jī)酸含量Table 4 Organic acids content of citrus fruit in different treatment times

2.1.4.2 對單果有機(jī)酸含量的影響

表4結(jié)果表明，水分脅迫條件下，柑橘果實的單果總有機(jī)酸含量在處理70、100、130 d時極顯著高于對照，而在處理10、40 d時極顯著低于對照；單果檸檬酸含量在處理70、100、130 d時極顯著高于對照，在40 d時極顯著低于對照；單果蘋果酸與奎寧酸總含量在處理10、100、130 d時極顯著低于對照，在處理70 d時極顯著高于對照；在處理130 d時，處理組果實的單果有機(jī)酸與檸檬酸含量分別較對照提高了11.3%和50.6%。綜合分析可知，40%水分脅迫雖然導(dǎo)致溫州蜜柑果實較對照小且輕，但其成熟果實整個果肉中的總有機(jī)酸與檸檬酸含量極顯著高于對照。從單果含量來看，40%水分脅迫同樣導(dǎo)致了果實檸檬酸積累，總有機(jī)酸含量增加，但單果蘋果酸與奎寧酸含量較對照低，表明40%水分脅迫下溫州蜜柑果實果肉中的檸檬酸與總有機(jī)酸含量較對照高不是由果實較對照小導(dǎo)致的。

2.2.1 對果實CitCS表達(dá)量的影響

圖1結(jié)果表明，處理組柑橘果實CitCS相對表達(dá)量在處理10、70、100 d時比對照高，分別為對照組的3.49、2.01和1.94倍；處理130 d時，對照組檢測不到CitCS相對表達(dá)量，處理組表達(dá)量達(dá)到最大值11.27；在處理40 d時，CitCS相對表達(dá)量較對照低，為對照組的0.62倍，表明40%水分脅迫條件下溫州蜜柑果實CitCS的相對表達(dá)量在處理40 d內(nèi)能夠恢復(fù)，超過40 d時表達(dá)量將持續(xù)升高。

圖1 不同處理時間CitCS的相對表達(dá)量Fig.1 Gene expressions of CitCS in citrus fruit at dif ferent treatment times

2.2.2 對果實CitACO表達(dá)量的影響

由圖2可知，處理組果實CitACO相對表達(dá)量在處理10、100、130 d時比對照高，分別為對照組的2.18、2.28、1.84倍，而在處理70 d時較對照低，為對照組的0.67倍；在處理40 d時，處理組與對照組的 CitACO表達(dá)量比較接近，分別為 0.90和0.87，表明 40%水分脅迫條件下溫州蜜柑果實CitACO的相對表達(dá)量在處理70 d內(nèi)能夠恢復(fù)，超過70 d時表達(dá)量將處于高水平。

圖2 不同處理時間CitACO的相對表達(dá)量Fig.2 Gene expressions of CitACO in citrus fruit at different treatment times

2.2.3 對果實CitIDH表達(dá)量的影響

圖3結(jié)果顯示，處理組柑橘果實的CitIDH相對表達(dá)量在處理40、70、130 d時比對照低，分別為對照組的0.86、0.49和0.58倍；在處理10 d時較對照高，為對照組的2.21倍；處理100 d時，處理組與對照組的 CitIDH表達(dá)量比較接近，分別為2.57和2.64，表明持續(xù)水分脅迫導(dǎo)致溫州蜜柑果實CitIDH表達(dá)量在果實發(fā)育40 d后低于或接近對照?？傮w而言，CitIDH的表達(dá)量較對照的低。

圖3 不同處理時間CitIDH的相對表達(dá)量Fig.3 Gene expressions of CitIDH in citrus fruit at different treatment times

2.2.4 CitCS, CitACO及CitIDH相對表達(dá)量與果實檸檬酸含量的相關(guān)性

由表5可見，在對照組果實中，CitIDH相對表達(dá)量與果肉檸檬酸含量存在顯著負(fù)相關(guān)，二者的相關(guān)系數(shù)為–0.8；CitACO相對表達(dá)量與單果檸檬酸含量的相關(guān)系數(shù)為–0.77，二者存在負(fù)相關(guān)。

表5 CitCS, CitACO及CitIDH的相對表達(dá)量與果實檸檬酸含量的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation co efficient between relative g ene ex pressions of CitCS, CitACO, CitIDH and citric acid content in citrus fruit

3 結(jié)論與討論

水分脅迫影響柑橘果實品質(zhì)，主要表現(xiàn)為可溶性固型物和有機(jī)酸含量上升[15]。本研究中，與對照相比，水分脅迫處理下柑橘果實生長受到明顯的抑制，果實的單果重、皮重、橫徑以及縱徑減小，果汁體積減小，維生素C含量減少，果實有機(jī)酸含量明顯增加，可溶性固型物含量增加。這與鄧勝興等[14]的研究結(jié)果類似。

水分脅迫導(dǎo)致檸檬酸積累而糖減少，是果實品質(zhì)下降的一個主要原因。水分脅迫下，果肉檸檬酸含量與單果檸檬酸含量均明顯升高，而果肉中的蔗糖、葡萄糖以及果糖含量雖有所增加，但其單果含量顯著減少，表明果肉糖含量增加是由水分脅迫抑制果實膨大引起的，水分脅迫導(dǎo)致單果糖含量的顯著減少和檸檬酸的明顯積累。檸檬酸含量在果實成熟后期會明顯下降。本研究中檸檬酸含量的降低實際上只體現(xiàn)在果肉含量上，單果含量并未減少。這表明后期檸檬酸含量下降是由果實體積和重量增大后水分大量進(jìn)入導(dǎo)致的。

本研究中CitCS的相對表達(dá)量隨脅迫時間的延長而升高，且與單果檸檬酸含量的變化趨勢一致；CitIDH的相對表達(dá)量變化恰好相反，隨脅迫時間的延長而降低。CitCS表達(dá)量較對照高和CitIDH表達(dá)量較對照低可能是水分脅迫條件下果實檸檬酸積累的原因之一。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Effects of water stress on the fruit quality of citrate and the expression of genes related to metabolism of citric acid

XIAO Yu-ming1,2, LU Xiao-peng1,2, HUANG Cheng-neng1,2, XIONG Jiang1,2, LI Jing1,2, XIE Shen-xi1,2*
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.National Center of Citrus Improvement, Hunan Changsha Subcenter, Changsha 410128, China)

The influence of water stress on fruit quality and gene expression related to citrate metabolism of citrus were conducted from July 5 to November 15 in 2012 using five-year-old satsuma mandarin trees with 40% soil water conditions by taken regular watering as control. The results showed that water stress significantly decreased single fruit weight, peel weight, fruit transverse and longitudinal diameter of citrus by 59.0%, 61.7%, 25.2% and 21.7% compared to the control, respectively. Water stress brought about the decrease of ascorbic acid and juice content in fruit, however, soluble solids was promoted. Furthermore, it was found that the content of sucrose, glucose, fructose and total sugar per gram sarcocarp in water stress were raised obviously by 33.3%, 72.3%, 65.0% and 48.9% respectively, the content of them in single fruit, while, were obviously declined by 42.1%, 25.1%, 28.3% and 37.8% respectively. The content of total organic acids and citric acid per gram sarcocarp were extremely increased by 66.3% and 60.4% respectively compared to those in the control. So did the content of citric acid and total organic acids per gram sarcocarp which were very significantly increased by 11.3% and 50.6% respectively. Related gene expression results indicated that the expression level of CitCS was increased while CitIDH degreased in water stress. CitACO was increased at the late stage of fruit growth. In general, water stress could obviously suppress the growth of satsuma mandarin and significantly caused theaccumulation of citric acid as well as lead to the decrease of sugar content in fruit, which resulted in the decline of the ratio of sugar to acid and fruit quality. The up-regulation of CitCS and down-regulation of CitIDH might be one of the reasons that promoted to the accumulation of citric acid.

citrus; water stress; fruit; quality; citric acid; gene expression

S666.01

A

1007?1032(2014)03?0281?07

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.012

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–03–07

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)體系項目(CARS)；國家自然科學(xué)基金(31071763)；湖南省科技計劃項目(2014NK3003)

肖玉明(1989—)，男，湖南衡陽縣人，碩士，主要從事果樹栽培生理生態(tài)與品質(zhì)調(diào)控研究；*通信作者，shenxixie@163.com