李麗麗，楊洪一

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

草莓斑駁病毒的分子雜交檢測

李麗麗1，楊洪一2*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

為探索分子雜交技術(shù)在草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)檢測中的運(yùn)用，利用CTAB法從草莓葉片中提取總核酸，并以此為模板，利用特異引物擴(kuò)增SMoV非編碼區(qū)序列，經(jīng)克隆、測序獲得SMoV非編碼區(qū)序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示：本研究中的分離物與GenBank中已報道的分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，獨(dú)立形成1個小的進(jìn)化支。以帶有病毒特異片段的質(zhì)粒為模板，運(yùn)用PCR技術(shù)制備了地高辛標(biāo)記的cDNA探針。以草莓感染SMoV葉片為試材，利用地高辛標(biāo)記探針可有效檢測草莓葉片中的SMoV，草莓總核酸樣品稀釋10倍后仍可有效檢測。

草莓斑駁病毒；分子雜交技術(shù)；cDNA探針

草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)是一種嚴(yán)重危害草莓生產(chǎn)的潛隱病毒，是分布最廣泛的草莓病毒之一[1]。SMoV病毒粒子為球形，直徑28～30 nm[2]。SMoV基因組包含2條單鏈RNA分子，3′末端均帶有Poly(A)尾，每個RNA分子編碼1個多聚蛋白[3-4]。草莓病毒的早期檢測方法主要為指示植物法。該方法檢測周期長，靈敏度較低[1]。草莓病毒在草莓植株中的分布量較少，且分布不均，常規(guī)的血清學(xué)技術(shù)難以應(yīng)用于草莓病毒檢測[5]?；诨蚪M學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外研究人員已獲得了SMoV、草莓皺縮病毒(Strawberry crinkle virus, SCrV)、草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)和草莓輕型黃邊病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)的基因組序列[5]，并以此為基礎(chǔ)，基于PCR技術(shù)對草莓病毒檢測進(jìn)行了探索[6–7]。由于高質(zhì)量草莓核酸的提取較困難，導(dǎo)致運(yùn)用PCR技術(shù)檢測草莓病毒的結(jié)果不穩(wěn)定[6–7]。利用RT–PCR技術(shù)檢測SMoV時，不同核酸提取方法檢測結(jié)果的差異較大[6]。分子雜交技術(shù)是將少量變性的核酸固定在固體支持膜上，用專一性檢測互補(bǔ)核酸序列的標(biāo)記探針與樣品進(jìn)行雜交的技術(shù)，再通過放射自顯影或酶標(biāo)顏色反應(yīng)進(jìn)行檢測。分子雜交技術(shù)檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，目前已成為檢測植物病毒的重要手段。在草莓病毒檢測中，目前已有利用分子雜交技術(shù)檢測SVBV的報道[5]，但尚無利用分子雜交技術(shù)檢測SMoV的報道。筆者對此進(jìn)行研究，旨在建立一種可快速、有效檢測SMoV的技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

感染SMoV的草莓植株取自黑龍江慶安農(nóng)村庭院草莓園，保存在東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方 法

1.2.1 草莓葉片總核酸提取

將感染SMoV的草莓幼嫩葉片在液氮中研碎，取約0.05 g加入到盛有500 μL CTAB提取緩沖液的1.5 mL Eppendorf管中，65 ℃水浴15 min。用500 μL體積比24∶1的氯仿、異戊醇抽提2次，上清液中加入1/4體積的10 mol/L LiCl。加入400 μL無菌水，14 000離心5 min，取上清。再加入400 μL體積比24∶1的氯仿、異戊醇，離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入 1/10體積 0.3 mol/L CH3COONa(pH5.2)、3倍體積無水乙醇，–20 ℃10 000 r/min離心10 min，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀2次，放置于超凈工作臺上吹干，加入50 μL DEPC水溶解。

1.2.2 RT–PCR反應(yīng)程序

引物D2、D3位于SMoV基因組的非編碼區(qū)，具體序列參見文獻(xiàn)[5]。引物由TaKaRa公司合成。

檢測SMoV的RT反應(yīng)體積為20 μL，其中包括模板1 μL，正義引物(10 μmol/L)1 μL，其他反應(yīng)成分與操作步驟參考Invitrogen反轉(zhuǎn)錄酶說明書，反轉(zhuǎn)錄時間2.5 h。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 特異片段的克隆和測序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa)回收目的片段，與pMD18–T載體(TaKaRa)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過PCR鑒定陽性克隆之后進(jìn)行測序[8]。利用BLAST工具，在GenBank中進(jìn)行相似性分析。利用DNAman軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 分子雜交技術(shù)檢測

利用DIG DNA標(biāo)記試劑盒(深圳萊伯克生物技術(shù)公司)，采用PCR技術(shù)制備cDNA探針。反應(yīng)體系共20 μL，包括正義引物(100 pmol/L)和反義引物(100 pmol/L)各 1 μL，DNA模板 1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，Dig–dUTP標(biāo)記混合物2 μL，Taq DNA聚合酶2 U/μL。反應(yīng)程序與RT–PCR反應(yīng)程序相同。

以草莓感染SMoV的葉片為試材，利用CTAB法提取總核酸，利用地高辛標(biāo)記探針對感染SMoV樣本進(jìn)行雜交檢測。雜交后加入抗地高辛堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，利用堿性磷酸酶和化學(xué)底物的作用檢測雜交信號。雜交檢測包括總核酸提取、預(yù)雜交、雜交、洗膜、信號檢測等步驟，按深圳萊伯克生物技術(shù)公司的雜交試劑盒說明書進(jìn)行操作。對總核酸樣品分別進(jìn)行10、100倍稀釋，分析分子雜交檢測的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用RT–PCR技術(shù)擴(kuò)增SMoV非編碼區(qū)

經(jīng)電泳分析，RT–PCR產(chǎn)物大小約220 bp，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。2.2 RT–PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測序及序列分析

圖1 SMoV非編碼區(qū)片段的RT–PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of agarose ge l e lectrophoresis for am plified t he fragment of non-coding region of SMoV

測序結(jié)果表明，質(zhì)粒中插入的DNA片段的大小為219 bp。BLAST結(jié)果顯示，質(zhì)粒中插入的DNA片段僅與GenBank中SMoV的非編碼區(qū)序列有同源性；與GenBank收錄號為AJ311875、AJ498586 和AJ496589的SMoV分離物的序列同源性最高，為97%，與GenBank收錄號為AJ496588 的SMoV分離物同源性最低，為92%。利用DNAman軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，本研究中獲得的分離物的非編碼區(qū)序列(ZX–SMoV)與 GenBank中已報道的分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)，獨(dú)立形成 1個小的進(jìn)化支。

圖2 基于SMoV部分非編碼區(qū)核苷酸序列的不同分離物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequence in non-coding region of SMoV from different isolates

2.3 SMoV的分子雜交技術(shù)檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，探針電泳條帶清晰整齊，并且探針條帶與RT–PCR產(chǎn)物的電泳條帶基本處于同一位置，表明得到的探針與RT–PCR產(chǎn)物的長度相近(圖3)。由于探針中含有地高辛，與RT–PCR產(chǎn)物相比，探針電泳略慢。電泳結(jié)果顯示，合成的探針與預(yù)期的相符。

圖3 地高辛標(biāo)記探針的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Result of agarose gel electrophoresis of the Digoxigenin labeled probe

如圖4所示，在草莓感染SMoV葉片核酸位置顯示黑色的化合物，證明有 SMoV的存在，陰性對照中未見雜交信號，總核酸稀釋10倍后仍可有效檢測，總核酸稀釋100倍后仍可見弱的雜交信號，說明整個探針及雜交體系是有效的，且靈敏度較高。

圖4 地高辛標(biāo)記cDNA探針檢測草莓葉片中SMoV的點(diǎn)雜交結(jié)果Fig.4 Result o f dot-hybridization for de tection of SMoV i n leaves of strawberry by digoxigenin labeled cDNA probe

3 結(jié)論與討論

PCR技術(shù)是檢測植物病毒最常用的技術(shù)之一，檢測靈敏度較高。草莓組織中富含次級代謝產(chǎn)物，如丹寧、多酚、多糖類物質(zhì)，這些次級代謝產(chǎn)物在提取核酸的過程中難以去除，抑制DNA聚合酶的功效，因而影響PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性。在檢測草莓病毒的研究中，Thompson等[6]系統(tǒng)研究了RNA提取方法對RT–PCR檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)使用Qiagen公司RNA提取試劑盒提取的核酸為模板，不同反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、不同PCR反應(yīng)的結(jié)果不同。本研究中核酸提取方法盡管步驟較繁瑣，但經(jīng)過多次沉淀和溶解，可將核酸中的大部分雜質(zhì)去除，因而RT–PCR結(jié)果較穩(wěn)定。

本研究中獲得的草莓病毒分離物是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民多年以匍匐莖無性繁殖擴(kuò)繁獲得的植株。中國早期栽培的草莓可能是自俄羅斯經(jīng)黑龍江傳入中國的[9]。本研究中草莓植株是否來源于此尚不確切。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，本研究中的SMoV分離物的非編碼區(qū)序列與GenBank中已報道的分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，獨(dú)立形成1個小的進(jìn)化支，因而該分離物可能是一個獨(dú)特的中國分離物。

SMoV株系變異復(fù)雜，其核苷酸序列變異也極為復(fù)雜，因而即使在其基因組保守區(qū)域(如非編碼區(qū))設(shè)計PCR引物也較困難，一些基于其他基因片段設(shè)計的引物僅能有效檢測部分株系[10]。分子雜交技術(shù)受病毒株系變異及核苷酸序列變異的影響較小，因而對所有分離物一般都可有效檢測。本研究結(jié)果表明，利用地高辛標(biāo)記的cDNA探針可有效檢測草莓葉片中的SMoV。分子雜交的缺點(diǎn)在于檢測成本略高，但近年來非放射性標(biāo)記物的價格正逐步下降。隨著新標(biāo)記物的不斷開發(fā)及已有標(biāo)記物價格的快速下降，分子雜交將在病毒檢測中發(fā)揮更大的作用。

本研究中技術(shù)體系的缺陷在于一次雜交反應(yīng)僅能檢測一種病毒，當(dāng)前病毒檢測的總體發(fā)展趨勢是同時檢測多種病毒。早期研究中，Saade等[11]利用分子雜交同時檢測3種植物病毒，即將蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus, ApMV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)和洋李矮縮病毒(Prune dwarf virus, PDV)的探針混合后進(jìn)行雜交反應(yīng)，陽性雜交結(jié)果則說明檢測樣品含有上述3種病毒中的1種或多種。受探針濃度、雜交反應(yīng)體系的影響，3種探針混合降低了探針的濃度，從而可能影響檢測的靈敏度?；蛐酒?DNA chip)技術(shù)本質(zhì)上也是基于分子雜交原理，其可同時檢測多種病毒，理論上可將所有的植物病毒整合在一張芯片上進(jìn)行檢測，但其靈敏度、穩(wěn)定性尚有待提高[12]。為了建立同時檢測多種病毒的技術(shù)體系，在本研究的基礎(chǔ)上，東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室正探索將不同草莓病毒的基因序列連接后制備成1個探針，以同時檢測多種草莓病毒。

[1] Frazier N W，Thresh J M，Varney E H．Virus Diseases of Small Fruits and Grapevines[M]．California：University of California Press，1970：4–8．

[2] Yoshikawa N，Converse R H．Purification and some properties of Strawberry mottle virus[J]．Anuals of Appied Biology，1991，118(3)：565–576．

[3] Thompson J R，Leone G，Lindner J L，et al. Characterization and complete nucleotide sequence of Strawberry mottle virus：A tentative member of a new family of bipartite plant picorna–like viruses[J]．Journal of General Virology，2002，83：229–239．

[4] Mayo M A．Changes to virus taxonomy[J]．Archives of Virology，2005，150：189–198．

[5] Martin R R，Tzanetakis I E．Characterization and recent advances in detection of Strawberry viruses[J]．Plant Disease，2006，90(4)：384–396．

[6] Thompson J R，Wetzel S，Klerks M M，et al．Multiplex RT–PCR detection of four aphid-borne Strawberry viruses in Fragaria spp．in combination with a plant mRNA specific internal control[J]．Journal of Virological Methods，2003，111：85–93．

[7] Posthuma K I，Adams A N，Hong Y，et al．Detection of Strawberry crinkle virus in plants and aphids by RT–PCR using conserved L gene sequences[J]．Plant Pathology，2002，51：266–274．

[8] 迪芬巴赫，德維克斯勒．PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M]．黃培堂，余煒源，陳添彌，等譯．北京：科學(xué)出版社，1998．[9] 張運(yùn)濤．草莓研究進(jìn)展(二) [M]．北京：中國林業(yè)出版社，2006．

[10] Thompson J R，Jelkmann W．The detection and variation of Strawberry mottle virus[J]．Plant Disease，2003，87(4)：385–390．

[11] Saade M，Aparicio F，Sanche–navarro J A，et al. Simultaneous detection of the three Illaviruses affecting stone fruit trees by nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse–transcription polymerase chain reaction[J]．Phytopathology，2000，90：1330–1336．

[12] 楊洪一，李麗麗，張志宏．果樹病毒核酸檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]．中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(2)：350–354．

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Detection of Strawberry mottle virus by molecular hybridization

LI Li-li1, YANG Hong-yi2*
(1.Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province, Harbin 150081, China; 2.College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

To validate the technique of molecular hybridization on the detection of Strawberry mottle virus (SMoV), total nucleic acid, which extracted from strawberry leaves using CTAB approach, was adopted as a template to be amplified with specific primers in non-coding region of SMoV. And then, sequences of SMoV were obtained after cloning and sequencing phases. The results of phylogenetic analysis indicated that there was a far relative between the isolate in this research and the reported isolates in GenBank, the isolate in the study formed a small unattached branch in phylogenetic tree. Using plasmid DNA with viral specific fragment as a template, a cDNA probe labeled with digoxigenin was prepared by PCR. SMoV could be efficiently detected by the cDNA probe in the test material of strawberry leaves infected by SMoV, as well as in the extreme case with 10 folds dilution solution of total nucleic acid. To our knowledge, this is the first report on the detection of SMoV by cDNA probe.

Strawberry mottle virus; molecular hybridization; cDNA probe

S668.4

A

1007?1032(2014)03?0273?04

10.13331/j.cnki.jhau.2014.03.010

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–10–16

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(DL13EA06–3)

李麗麗(1978—)，女，遼寧阜新人，博士，助理研究員，主要從事微生物學(xué)研究；*通信作者，yhyi1@sohu.com