汪 靜 杭州市第一人民醫(yī)院藥劑科 杭州 310006

HPLC法同時(shí)測定紅曲中兩種構(gòu)型洛伐他汀的含量

汪 靜 杭州市第一人民醫(yī)院藥劑科 杭州 310006

紅曲；洛伐他汀；HPLC

紅曲為紅曲菌（Monascus）的發(fā)酵產(chǎn)物，古代稱丹曲，是我國傳統(tǒng)中藥，李時(shí)珍在《本草綱目》谷部中記載：“紅曲，甘、溫、無毒，主治消食，活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷”[1]。研究表明，紅曲中所含有的洛伐他?。∕onacolin K）具有降血脂、降血壓、降低膽固醇等作用[2]，其所含有的Monacolin K具有酸型（開環(huán)型）和內(nèi)酯型（閉環(huán)型）兩種結(jié)構(gòu)形式。研究表明，Monacolin K由內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成酸型結(jié)構(gòu)后，抑制膽固醇生物合成中關(guān)鍵酶的能力大約是內(nèi)酯性的2倍[3-4]，Monacolin K在人體內(nèi)通常由內(nèi)酯型水解成酸型，進(jìn)而起到較好的降血脂效果。然而，在實(shí)際應(yīng)用中Monacolin K的含量也并非越高越好，應(yīng)該對其進(jìn)行適量應(yīng)用。目前，對紅曲中所含有的內(nèi)酯型Monacolin K含量研究較多，但并不能準(zhǔn)確的代表兩種構(gòu)型Monacolin K的含量。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC同時(shí)法，對藥材市場上紅曲中所含有的兩種構(gòu)型Monacolin K含量進(jìn)行測定，為紅曲的進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材 料 紅曲購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠（20120819）。洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)100601-200502），購自中國藥品生物制品鑒定所）、乙腈（20120311），其它試劑如：甲醇、磷酸等均為分析純。

1.2 儀 器 METTLER TOLEDO AB204-3電子天平（梅特勒托利多電子天平生產(chǎn)廠）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent1200液相色譜儀（Agilent公司）；色譜柱：ODS-C18柱（250mm×4.6mm×5μm）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 內(nèi)酯型對照品溶液的配置 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（Monacolin K）10.65mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，超聲溶解30min，冷卻，搖勻。制成0.213mg/mL的對照品儲(chǔ)備液。精密吸取對照品儲(chǔ)備液5.0mL于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為42.6ug/mL的對照品溶液，備用。

2.1.2 酸型對照品溶液的配置 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（Monacolin K）10.00mg，置于50mL容量瓶中，加4mL甲醇溶解，然后加20mL 0.2mol/L氫氧化鈉溶液[5-8]，超聲30min，冷卻，用3mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH至6左右[5]，加甲醇定容，稀釋至所需濃度即可。該方法不僅所需時(shí)間短，而且洛伐他汀（內(nèi)酯型Monacolin K）完全轉(zhuǎn)化為酸型Monacolin K，見圖1。

2.2 樣品溶液的制備 精密稱定紅曲樣品0.30g，置于50mL錐形瓶中，加20mL甲醇提取，超聲1h，冷卻，抽濾，濃縮、定容至10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度。取樣品溶液，離心10min后（3000r/min），用0.45μm微孔濾膜過濾，待測。

2.3 檢測條件的選擇 通過全波段掃描[9]，得出波長在230nm～254nm下對照品的吸收峰相對較大，對230、238、254nm波長下的對照品進(jìn)行測定，得出在238nm波長下所測得目標(biāo)成分峰面積最大，因此，本實(shí)驗(yàn)選取238nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測波長。

實(shí)驗(yàn)選取常用流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸（80:20）為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為室溫。

2.4 內(nèi)酯型和酸型Monacolin K的定性測定 取內(nèi)酯型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定，進(jìn)樣20μL，所測目標(biāo)成分在6.582min處有唯一吸收峰，見圖1。取處理好的酸型Monacolin K對照品溶液，所測得目標(biāo)成分在4.465min處有唯一吸收峰，見圖2。

圖1 酸型Monacolin K對照品的色譜圖

圖2 內(nèi)酯型Monacolin K對照品的色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密移取0.213mg/mL的對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0和15.0mL，各置于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為8.52、17.04、42.60、85.20和127.80μg/mL的對照品，檢測波長為238nm，進(jìn)樣量為20μL。以Monacolin K的含量X為橫坐標(biāo)，吸光值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=65152x+15793，r= 0.9999，表明Monacolin K在8.52-0.17280μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度測定 取“2.1.1”制備的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20μL，在238nm波長下檢測，連續(xù)測定5次，所測5次峰面積的RSD=1.45%，精密度實(shí)驗(yàn)符合要求（＜3%），表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別測定放置0、30、60、120、180、240min后，分別進(jìn)樣20μL，在238nm波長下檢測（以內(nèi)酯型Monacolin K計(jì)算）。所測得6次峰面積的RSD= 1.73%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知濃度的樣品，分別加入高、中、低三種濃度的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液（以內(nèi)酯型Monacolin K計(jì)算）進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.81%，RSD為0.27%（n=9），表明方法的準(zhǔn)確性良好，方法可行。結(jié)果見表1。

表1 Monacolin K加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.9 樣品中Monacolin K計(jì)算及含量測定 內(nèi)酯型Monacolin K濃度=（內(nèi)酯樣品面積/標(biāo)品面積）×標(biāo)樣濃度；酸型Monacolin K濃度=（酸樣品面積/標(biāo)品面積）×標(biāo)樣濃度×1.0445；樣品中總Mnacolin K%=（內(nèi)酯型濃度+酸型濃度）/樣品濃度×100%；因每一分子酸型Mnacolin K比內(nèi)酯型Monacolin K多一分子水，故應(yīng)乘以系數(shù)酸型結(jié)構(gòu)分子量與內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)分子量之比1.0445。

取紅曲按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖（見圖3），記錄峰面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線及內(nèi)酯型和酸型Monacolin K濃度的計(jì)算方法，計(jì)算樣品含量，本實(shí)驗(yàn)測得內(nèi)酯型Monacolin K含量為0.46mg/g，酸型Monacolin K含量為0.19mg/g，本品紅曲中內(nèi)酯型Monacolin K占了兩種Monacolin K的70.77%。

圖3 紅曲樣品的HPLC色譜圖：1酸型峰；2內(nèi)酯型峰

3 討論

酸型結(jié)構(gòu)Monacolin K不穩(wěn)定，容易脫水形成Monacolin K內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)，不宜作為標(biāo)準(zhǔn)品，本方法用Monacolin K內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)作為標(biāo)準(zhǔn)品，對水解形成的Monacolin K酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性和定量，再用它們對樣品進(jìn)行定性和定量分析。酸型Monacolin K的標(biāo)準(zhǔn)樣品可以通過內(nèi)酯型Moancolin K（Lovastatin）的標(biāo)準(zhǔn)品制取。本實(shí)驗(yàn)中的HPLC檢測條件對Monacolin K的兩種形態(tài)都有很好的分離效果。酸型Monacolin K的出峰時(shí)間約為4.4min，內(nèi)酯型Monacolin K的出峰時(shí)間約為6.5min。

干燥的固體紅曲樣品可以近似認(rèn)為沒有水分存在。而Monacolin K在甲醇中的離解常數(shù)非常小，遠(yuǎn)小于在水中的離解常數(shù)。因而用甲醇萃取時(shí)基本上不存在Monacolin K兩種形態(tài)發(fā)生互變的情況，所以能真實(shí)反映原樣品中Monacolin K兩種形態(tài)的比例。能很好的杜絕一些廠家將洛伐他汀參入紅曲中的不良行為，適用于保健食品紅曲的分析。

隨著Monacolin K檢測方法的改進(jìn)，桔霉素檢測方法的建立，紅曲產(chǎn)品質(zhì)量的不斷提高，功能性紅曲作為保健食品和藥品的一個(gè)新領(lǐng)域，將會(huì)為人類的健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。

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2013-09-23