王振斌 趙 帥 邵淑萍 王 璽

(江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013)

淀粉是一種天然半結晶顆粒結構的高聚物，存在結構和性能缺陷，結晶區(qū)分子排列緊密，導致水、酶及多數化學試劑不易接觸到結晶區(qū)內分子，從而表現出不溶于冷水、淀粉糊易老化脫水、缺乏乳化力，以及淀粉糊在酸、熱和剪切力作用下不穩(wěn)定，化學反應效率較低等現象［1］。

隨著淀粉工業(yè)的不斷發(fā)展，淀粉糖化工藝在制糖、酒精、有機酸發(fā)酵等行業(yè)中的地位日益重要。然而目前存在的淀粉利用率低下等問題，已經成為淀粉產業(yè)發(fā)展的瓶頸，尋找提高原料淀粉轉化率的有效途徑成為研究的熱點之一。

超聲波是頻率高于20 kHz的聲波，是一種彈性機械波，近年來在物理、生物、化學等領域中已有廣泛應用。超聲波處理能使生物質高分子的形態(tài)結構和超微結構發(fā)生明顯變化，有利于提高酶的可及度和化學反應性能［2－10］。目前還未見對超聲波輔助液化酶和糖化酶雙酶法水解淀粉以提高其轉化率的研究報道。

本試驗采用超聲波輔助液化酶和糖化酶水解淀粉，并分析其作用機理，以期提高淀粉利用率，對開發(fā)較高活性的淀粉改性產品起到積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料

水磨糯米粉:金壇市江南制粉有限公司;高溫α－淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(100 000 U/g):江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

JY92－ⅡDN型超聲波細胞粉碎機:寧波新芝生物科技股份有限公司;HH－A型恒溫水浴攪拌器:江蘇金壇市中大儀器廠;UV－1601型紫外可見分光光度計:北京北分瑞利分析儀器有限公司;JSM－7001F型掃描電子顯微鏡:日本電子株式會社;NEXUS 0410型紅外分光光度計:美國熱電尼高力公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 淀粉雙酶水解工藝

將淀粉和蒸餾水按一定比例進行混合，然后用0.1 mol/L 的 HCl溶液調 pH 值為 5.6 ±0.2，加入液化酶(耐高溫α－淀粉酶10 U/g原料)，于95℃恒溫水浴攪拌器中進行液化反應，液化完成后，冷卻至60℃，用HCl溶液調pH值為2.2，滅酶30 min，然后用 1 mol/L NaOH 調 pH 4.2～4.4，加入糖化酶(糖化酶300 U/g原料)，放入60℃恒溫水浴攪拌器中進行糖化反應。

1.2.2 超聲輔助淀粉雙酶水解工藝

液化過程超聲處理:稱量一定質量的淀粉和蒸餾水，調漿成質量濃度10%～30%的淀粉乳。取200mL淀粉乳于300 mL燒杯中，調pH，燒杯放入95℃恒溫水浴攪拌器中，將超聲波變幅桿插入淀粉乳液面以下2 cm，磁力攪拌轉速50%，超聲(工作時間/間歇時間=2 s/4 s)輔助液化一定時間，液化完成后，冷卻，滅酶，測其液化值，然后按1.2.1節(jié)的方法進行糖化，測其DE值。

糖化過程超聲處理:稱量一定質量的淀粉和蒸餾水，調漿成質量濃度10%～30%的淀粉乳。取200 mL淀粉乳于300 mL燒杯中，然后按1.2.1方法進行液化，滅酶，液化完成后，將超聲波變幅桿插入淀粉乳液面以下2 cm，磁力攪拌轉速50%，超聲(工作時間/間歇時間=2 s/4 s)輔助糖化一定時間，糖化完成后，冷卻，測其DE值。

1.3 分析方法

1.3.1 液化值的測定

采用DNS法進行。取淀粉液化液1 mL，定容至100 mL，過濾，取1 mL 濾液，參考趙凱等［11］的方法，繪制標準曲線(圖1)，并按照式(1)計算液化值。

式中:A為吸光值;n為稀釋倍數。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.2 DE 值測定

參考GB/T 22428.1—2008淀粉水解產品 還原力和葡萄糖當量測定。

1.3.3 電鏡掃描

在60℃水浴中，將20%原淀粉乳樣品進行0、100、200、300 W超聲處理，處理時間為10 min，凍干，密封保存。測試時將樣品置于掃描電子顯微鏡中觀察，拍攝具有代表性的顆粒形貌。

1.3.4 溶解度的測定方法

準確稱取純干糯米淀粉樣品2.000 0 g，在攪拌條件下緩慢加入100 mL蒸餾水中，在功率100 W，頻率 20 kHz，溫度 20、40、60、80、100 ℃ 的超聲波環(huán)境下處理10 min，冷卻，3 000 r/min離心15 min。取上清液25 mL，110℃干燥8 h，稱重，試驗重復3次。溶解度以淀粉溶解的質量占原來淀粉質量的百分比計算。

1.3.5 淀粉－碘復合物吸收光譜分析

取質量濃度0.01%的淀粉乳8 mL，加入0.2 mL碘液(I22.0 mg/mL+KI 20 mg/mL)，混勻靜置 10 min，用分光光度計從400～900 nm做連續(xù)波長掃描，以稀碘液(0.2 mL上述碘液+8 mL蒸餾水)作空白。

1.3.6 紅外光譜分析

采用KBr壓片法。取少量研磨后的淀粉和KBr混合物粉末，壓片后置于紅外光譜儀內全波段掃描(掃描范圍:4 000～400 cm－1)，繪出紅外光譜圖。對比超聲處理前后淀粉的紅外譜圖，考察超聲作用對淀粉分子基團及結晶度的影響。

1.3.7 耐高溫α－淀粉酶活力測定

參考GB 8275—2009食品添加劑α－淀粉酶制劑。

1.4 數據處理

采用Originpro 7.5統(tǒng)計分析軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助淀粉乳液化對其液化值及DE值的影響

超聲波對淀粉乳液化過程中液化值及DE值的影響的結果如圖2所示?？梢钥闯觯诘矸廴闈舛?0%，超聲波功率100 W，超聲時間10 min，總液化時間50 min條件下，超聲波處理的淀粉乳與未加超聲波處理的淀粉乳相比，其液化值從22.67 mg/mL升到38.86 mg/mL，DE 值從82.70%升到94.30%。其原因一方面可能是超聲波對淀粉乳的作用，如:1)超聲波作用破壞淀粉顆粒表面的水束層，使水分滲入淀粉顆粒，有利于淀粉酶對淀粉的水解;2)超聲波“空穴效應”產生的剪切力切斷淀粉的長鏈，有利于淀粉的酶解;3)超聲波產生的自由基能夠攻擊淀粉分子，導致1，4－糖苷鍵的斷裂，淀粉長鏈暴露出大量非還原性末端，為酶解提供了更多的底物;4)超聲波的機械攪拌作用使整個反應體系更均勻，底物與酶活性部位的接觸頻率增加。另一方面可能是超聲波對酶的作用，如:1)超聲波空穴作用引起的水和空氣間界面面積增大，擾亂了酶分子周圍環(huán)境，如氫鍵和疏水作用，導致酶分子構象的變化;2)超聲波產生剪切力和沖擊波造成酶分子結構的變化，表現出酶活的變化。因此，超聲波對酶的影響，既可表現為激活酶的活性，促進酶的催化作用，也可表現為鈍化酶的活性，降低酶的催化速度，其作用效果受超聲波條件的影響［12－14］。

圖2a是超聲波功率對淀粉酶解效率的影響結果。淀粉液化過程中，在淀粉乳濃度20%，總液化時間50 min，液化起始施加超聲波10 min，超聲波功率分別為 0、50、100、150、200、250 W 條件下，淀粉乳的液化值及DE值隨著超聲波功率的增加出現了先升后降的趨勢，在超聲波功率100 W時，液化值和DE值均達到最大值30.67 mg/mL和94.30%。分析其原因，可能是因為隨著超聲波功率的增加，淀粉顆粒變小，溶解度增加，或者淀粉酶的空間結構改善，從而表現為淀粉的液化值和DE提高;繼續(xù)增加超聲波功率，過高的超聲波能量破壞了淀粉酶的空間結構，酶活性反而降低，使得淀粉的液化值和DE下降。

圖2 超聲波輔助淀粉乳液化過程對其液化值及DE值的影響

圖2b是超聲波時間對淀粉酶解效率的影響結果。在超聲波功率100 W的條件下，液化起始施加超聲波0、6、8、10、12、14 min，淀粉乳液化值和 DE 值隨著超聲時間的延長，淀粉乳的液化值和DE值也出現了先升后降的趨勢，在超聲時間10 min時，液化值和DE值達到最大值30.67 mg/mL和94.3%。分析其原因，可能是因為隨著超聲波時間的延長，有利于淀粉的溶解、酶的空間結構改善和淀粉與酶的有效接觸幾率的提高，而超聲波處理時間過長，使得淀粉酶空間結構破壞，酶活性降低。

圖2c是淀粉乳濃度對超聲波輔助淀粉酶解效率的影響。在超聲波功率100 W，液化起始施加超聲波10 min的條件下，淀粉乳濃度分別為10%、15%、20%、25%、30%時，隨著淀粉乳濃度的增加，其液化值和DE值同樣出現先升后降的趨勢。在淀粉乳濃度達到20%時，DE值達到最大值94.30%，液化值為30.67 mg/mL。在淀粉乳達到25%時，液化值達到最大值38.86 mg/mL，DE值為90.96%。分析其原因，可能是因為隨著淀粉乳濃度的增加，底物與酶有效碰撞幾率增加，從而提高了酶解效率;過高的淀粉乳濃度，一方面降低了酶解體系的傳質系數，另一方面阻礙了超聲波在體系中傳遞，底物與酶分子反應后的產物不易及時分離，新的酶解反應界面難以形成，降低了淀粉酶解的效率。

2.2 超聲波輔助淀粉乳糖化對其DE值的影響

在淀粉酶解過程中，先不加超聲波液化50 min，然后進行超聲波輔助糖化，其DE值的變化如圖3所示。可以看出，在超聲功率150 W，超聲時間10 min，淀粉乳濃度20%的條件下，超聲輔助糖化的淀粉乳與未加超聲波相比，淀粉乳的DE值由82.7%上升到87.31%。從圖3a、3b和圖3c可以看出，在淀粉糖化過程中，超聲波功率、超聲波時間和淀粉乳濃度對淀粉乳DE值的影響均表現出先升后降的趨勢，這與其在淀粉液化過程中對淀粉液化值和DE值的影響趨勢一致。在超聲波功率150 W、超聲波時間10 min、淀粉乳濃度20%時，DE值達到最大值87.31%，低于超聲波輔助液化時的94.30%，說明超聲波輔助淀粉液化與超聲波輔助糖化相比較，具有顯著的優(yōu)勢。分析其原因，可能是因為超聲波在一定程度上可以提高淀粉乳的糖化，而淀粉的液化和糖化是一個連續(xù)的酶解過程，液化比糖化更為重要;超聲波輔助液化，有利于淀粉大分子的降解，可酶解淀粉的比率提高，為糖化過程提供了充足的底物。

圖3 超聲波輔助淀粉乳糖化過程對DE值的影響

3 討論

研究超聲波對淀粉糖化過程的影響，體現在超聲波對淀粉特性和超聲波對淀粉糖化過程中所涉及到的酶的影響。研究超聲處理后淀粉理化特性變化，作用機理及開發(fā)高活性的淀粉改性產品都有重要意義。其次，超聲波釋放的能量促使酶分子構象發(fā)生改變，導致酶分子的生物學功能發(fā)生變化，主要體現在超聲波對酶活力的促進作用和鈍化作用。超聲波對酶的作用由于超聲波處理的條件和強度的不同對酶的作用也不同。

3.1 超聲波功率對淀粉乳微觀形態(tài)影響的分析

由圖4可見，糯米原淀粉表面平滑，無小孔裂縫或破面。從圖4b到圖4d可以看到，隨著超聲功率的增加，表面受侵蝕的淀粉顆粒增多，空洞變大，變深，裂紋增多，顆粒內部受侵蝕出現凹陷甚至缺損。由于淀粉顆粒內部主要是非結晶區(qū)，外層為堅固的結晶區(qū)，對化學試劑和酶有較強的抵抗能力，所以化學試劑一般很難滲透進入未經處理的原淀粉顆粒內部。結果表明，超聲作用破壞了淀粉顆粒表層結晶結構。因此，根據淀粉顆粒結構的變化能較好的解釋超聲處理能促進淀粉化學反應活性［15］。

圖4 不同超聲功率下淀粉乳微觀形態(tài)電鏡掃描圖

3.2 紅外光譜分析

由于淀粉是一種多晶高聚物，結晶高聚物在紅外光譜圖上具有特定的結晶敏感吸收帶，其強度與結晶度有關，結晶度增加，結晶區(qū)強度增大，結晶度下降，無定形區(qū)強度增大。因此，利用晶帶可以測定結晶聚合物的結晶度。根據Nelson等［18］測定結晶度的方法得到淀粉紅外結晶指數計算公式［17］:

式中:N－O'KI為紅外結晶指數，T1158和T2931分別為1 158 cm－1和2 931 cm－1的透光率。

圖5中1 158 cm－1處的吸收峰代表C－O－C不對稱伸縮振動，2 931 cm－1處的吸收峰代表C－CH2－C的不對稱伸縮振動，利用這2個伸縮振動可以較好地表征淀粉的結晶度變化。

由圖5可見，超聲波處理后淀粉與原淀粉相比，各特征基團的吸收峰位置與原淀粉相差不大，沒有新的吸收峰出現，仍具有原有官能團，說明超聲波未破壞淀粉的原有基本結構，沒有新的化合物產生，但1 158 cm－1和2 931 cm－1附近譜帶強度發(fā)生了變化。按式(2)計算超聲波處理前后淀粉的紅外結晶指數，結果見表1，從未經處理時的1.689下降到1.370，說明超聲波破壞了淀粉結晶結構?？栈瘹馀莓a生的高壓和局部激流有足夠的剪切力來打破聚合鏈，導致淀粉結晶區(qū)甚至整個淀粉顆粒的斷裂，這也是淀粉活性增加的主要原因［18－19］。

圖5 淀粉紅外光譜圖

表1 超聲波對淀粉結晶指數的影響

3.3 淀粉－碘復合物分析

淀粉是白色無定形粉末，由直鏈淀粉(占10%～30%)和支鏈淀粉(占70%～90%)組成。直鏈淀粉能溶于熱水而不呈糊狀，支鏈淀粉不溶于水，熱水與之作用則膨脹而成糊狀。其中溶于水中的直鏈淀粉，呈彎曲形式，并借分子內氫鍵卷曲成螺旋狀。這時加入碘酒，其中碘分子便鉆入螺旋當中空隙，并借助范得華力與直鏈淀粉聯系在一起，從而形成絡合物。這種絡合物能比較均勻地吸收除藍光以外的其他可見光，從而使淀粉變?yōu)樯钏{色。

圖6 經不同時間超聲處理的淀粉與碘形成復合物的吸收光譜

由圖6可見，隨超聲波處理時間的延長，淀粉－碘復合物的吸光度變大，表明直鏈淀粉在增加，超聲波致使部分支鏈斷裂，淀粉與碘的結合能力增強。可見，超聲波對淀粉大分子鏈的降解是有利的，而且這種降解作用隨著時間的延長越明顯。

3.4 超聲波對糯米淀粉溶解度的影響

由圖7可知，糯米粉溶解過程經超聲處理后，其溶解度增加，在100℃時，溶解度由6.2%上升至21.5%，顯著高于為超聲處理組。超聲波能在較短時間內破壞淀粉結晶區(qū)，顆粒表面及內部均遭到侵蝕，淀粉與水分子間締合增加，淀粉溶解度增大［20］。由于淀粉經超聲處理，其顆粒表面及結晶結構受到破壞，結晶度下降，淀粉酶擴散阻力下降，這也對淀粉的酶解過程有利。

圖7 超聲波處理對不同溫度淀粉溶解度的影響

3.5 超聲波對α－淀粉酶酶活的影響

由圖8可知，α－淀粉酶經過不同功率的超聲處理后，酶活力出現變化，激活酶的最適功率為100 W，此時酶活力比對照升高12.33%。由圖9可知，當α－淀粉酶經過100 W的超聲處理不同時間后，酶活力出現變化，對酶活力提高最多的處理時間為10 min，此時酶活力比對照提高15.29%。其最佳條件為功率100 W，超聲處理時間10 min?？梢钥闯?，不同條件的超聲處理對酶產生不同的影響，可激活酶的活性，促進酶的催化作用，也可鈍化酶的活性［21］。

圖8 超聲功率對α－淀粉酶酶活的影響

圖9 超聲時間對α－淀粉酶酶活的影響

4 結論

4.1 在超聲功率100 W，超聲時間10 min，淀粉乳濃度25%的條件下，淀粉乳液化值及DE值從未處理樣 品 的 19.89mg/mL、82.06% 分 別 提 高 到30.67 mg/mL、94.56%。

4.2 超聲波處理對淀粉特性及酶活的影響包括:淀粉顆粒在超聲波處理后，其顆粒表面出現凹陷和斷裂，受侵蝕的顆粒數量增多;溶解度提高;淀粉分子發(fā)生降解，淀粉鏈斷裂，直鏈淀粉含量增加;超聲作用沒有改變淀粉原有分子基團，但破壞了淀粉結晶結構，結晶度下降;適宜的超聲波條件使得α－淀粉酶活力提高，這些都有利于淀粉的酶解。

［1］楊景峰，羅志剛，羅發(fā)興.淀粉晶體結構研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2007(7):240－243

［2］Shogren R L.Modification of maize starch by thermal processing in glacial acetic acid［J］.Carbohydrate Polymers，2000，43:309－315

［3］Wang Zhenbin ，Ling Xiaoming，Li Pingping，et al.Effects of low intensity ultrasound on cellulase pretreatment［J］.Bioresource Technology ，2012，117:222 －227

［4］趙旭博，董文賓，于琴，等.超聲波技術在食品行業(yè)應用新進展［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26(1):3 －7

［5］石文奇，易長海，甘厚磊，等.超聲波對液體α－淀粉酶酶學活性的影響［J］.天津工業(yè)大學學報，2012，31(2):43 －46

［6］陳小麗，黃卓烈，何平，等.超聲波對木瓜蛋白酶催化活性影響的機理研究［J］.應用聲學，2008，27(6):469－474

［7］朱國輝，黃卓烈，徐鳳彩，等.超聲波對菠蘿果蛋白酶活性和光譜的影響［J］.應用聲學，2003，22(6):10 －14，38

［8］孫俊良，曾潔，李光磊，等.超聲波輔助酶解淀粉制備糊精的工藝研究［J］.食品科學，2009，30(18):126－130

［9］Monika S，Jerzy J.Ultrasound － treated starch:SEM and TEM imaging，and functional behaviour［J］.Food Hydrocolloids，2013，31:413 －419

［10］賈淑麗，侯紅萍.超聲波預處理優(yōu)化生高粱粉糖化工藝的研究［J］.中國釀造，2012，31(2):49 －53

［11］趙 凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究［J］.食品科學，2008，29(8):534－536

［12］Felipe F，Lima，Cristina T.Effect of melt－ processing and ultrasonic treatment on physical properties of high－amylose maize starch［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2010，17:637－641

［13］Zhu Jie，Li Lin，Chen Ling，et al.Study on supramolecular structural changes of ultrasonic treated potato starch granules Original Research Article［J］.Food Hydrocolloids，2012，29:116－122

［14］林建萍，黃強，樓建明.超聲波在淀粉變性上的應用［J］.上海紡織科技，2002，30(4):22 －23

［15］黃祖強，陳淵，錢維金，等.機械活化對玉米淀粉結晶結構與化學反應活性的影響［J］.化工學報，2007，58(5):1307－1313

［16］Nelson M L，O’Connor R T.Relation of certain infrared bands to cellulose crystallinity and crystal lattice type.Part II.A new infrared ratio for estimation of crystallinity in celluloses I and II［J］.Journal of Applied Polymer Science，1964，8:1325 －1341

［17］趙奕玲，童張法.超聲波對木薯淀粉性質及結構的影響［D］.南寧:廣西大學，2007

［18］李玥，鐘芳，麻建國.大米淀粉糊化過程的光譜分析［J］高分子學報，2008，7:720 －724

［19］Anet R J，Zoran H，Drago.Ultrasound effect on physical properties of corn starch［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79:91－100

［20］藍麗紅，李冬雪，陳阿明，等.超聲波作用對木薯淀粉顆粒結晶的影響［J］.安徽農業(yè)科學，2012，40(17):9192－9195，9208

［21］梁春虹，黃惠華.超聲波場致效應對酶的影響［J］.食品與機械，2007，23(2):133 －136.