朱曉媛 胡 鐵 張 蕾 蔣麗娟 黎繼烈

(中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，長(zhǎng)沙 410004)

(廣州航海學(xué)院2，廣州 510725)

纖維素酶是水解纖維素類(lèi)物質(zhì)的一組酶的總稱(chēng)，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品深加工、新能源生產(chǎn)等領(lǐng)域。纖維素酶作為新型飼料添加劑，顯著提高飼料消化率和利用率，改善家禽生產(chǎn)性能［1－2］。近年來(lái)，纖維素酶在農(nóng)產(chǎn)品深加工及副產(chǎn)品綜合利用方面受到越來(lái)越多的關(guān)注。利用纖維素酶水解秸稈、稻殼等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品制備還原糖，進(jìn)而生產(chǎn)燃料乙醇、乳酸等［3－4］。利用單一纖維素酶或以纖維素酶為主的復(fù)合酶輔助提取植物油如玉米胚芽油［5］、菜籽油［6］、橡膠籽油［7］等，顯著提高油脂得率。另外，新型纖維素酶改性農(nóng)業(yè)秸稈制備的水體溢油吸附劑性能良好，綠色環(huán)保，具有較好的應(yīng)用前景［8］。然而，纖維素酶的高成本成為限制其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸［9］。纖維素酶來(lái)源廣泛，細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌均可生產(chǎn)纖維素酶。細(xì)菌和放線(xiàn)菌生產(chǎn)的纖維素酶是胞內(nèi)酶，不僅產(chǎn)量低，而且對(duì)結(jié)晶纖維素不具酶活性［10］。因而纖維素酶大多是由絲狀真菌生產(chǎn)，包括曲霉、木霉和青霉等。曲霉分泌的葡聚糖纖維二糖水解酶活性低，木霉無(wú)法利用木質(zhì)素且分泌的β－葡萄糖苷酶活性低，因而在一定程度上限制了其應(yīng)用生產(chǎn)。青霉具有分泌纖維素酶組分齊全、酶活較高的生物學(xué)特性，而且具有易培養(yǎng)和生長(zhǎng)快的優(yōu)勢(shì)［11］。然而，目前已報(bào)道的青霉纖維素酶生產(chǎn)水平較低，酶活較低［12－13］，不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的高產(chǎn)菌株青霉Penicillium sp.1407為研究菌株，利用廉價(jià)的麩皮作為碳源，采用單因素和Box－Behnken試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在獲得最優(yōu)培養(yǎng)條件，提高目標(biāo)菌種產(chǎn)纖維素酶效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:本實(shí)驗(yàn)室自行分離，經(jīng)鑒定為青霉Penicillium，命名為 Penicillium sp.1407。

活化培養(yǎng)基:麩皮5%、瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯20%、蔗糖2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮2.95%、藥媒3.18%、胰蛋白胨0.4%、微晶纖維素 3.79%、磷酸二氫鉀 0.25%、硫酸鎂 0.03%、氯化鈣0.03%、硫酸銨 0.2%。

試劑:葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5－二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氫氧化鈉等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將斜面保存菌種移接于新鮮的活化培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)5～6 d。再用250 mL搖瓶裝種子培養(yǎng)基50 mL，接斜面活化好的菌種兩環(huán)，在28℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)1～2 d制備種子液。以一定接種量將種子液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵搖瓶中，500 mL搖瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，按照一定的發(fā)酵條件培養(yǎng)。所得發(fā)酵液于8 000 r/min，4℃離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 纖維素酶活力測(cè)定

取經(jīng)40℃預(yù)熱的稀釋粗酶液0.5 mL，加入經(jīng)40℃預(yù)熱的CMCNa液1.5 mL，40℃恒溫振蕩反應(yīng)20 min，立即加入DNS試劑3 mL，沸水浴中煮沸7 min，終止反應(yīng)，加入蒸餾水10 mL混勻，冷卻后測(cè)定還原糖的含量。

纖維素酶活力定義:在pH 4.8，40℃條件下，單位體積纖維素酶每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(IU/mL)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

《明報(bào)》之后，他的江湖早只剩下了武俠的江湖，曾經(jīng)縱橫論政、夜半文章的政論世界早已消失。但如果靠著他的武俠小說(shuō)，他建造的這個(gè)江湖世界也許真的可做到以一人敵一國(guó)，那是母語(yǔ)的力量，是他用母語(yǔ)造出來(lái)的一個(gè)世界?？梢哉f(shuō)，他創(chuàng)造了一個(gè)人的江湖，這里有水深浪闊、風(fēng)波不息，也曾有俠骨柔情、劍膽琴心，哪怕如今只留下渾渾噩噩、茍茍且且。

由單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵條件(搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、接種量、初始 pH、發(fā)酵時(shí)間)對(duì) Penicillium sp.1407產(chǎn)纖維素酶的影響，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.4 Box－Behnken試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響較大的因素進(jìn)行Box－Behnken試驗(yàn)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.1對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)纖維素酶活力的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)纖維素酶活力的影響如圖1所示，搖床轉(zhuǎn)速低于180 r/min時(shí)，發(fā)酵液中纖維素酶活力較低。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)低影響菌絲體的分散，不利于菌種對(duì)培養(yǎng)基養(yǎng)分的吸收利用，也不利于菌絲體伸展，抑制其呼吸作用。搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)維素酶活力較高，這是由于加大轉(zhuǎn)速可增大通氣量，提高發(fā)酵液中溶氧濃度，因而有助于菌體生長(zhǎng)并提高菌種產(chǎn)酶活性。但過(guò)高轉(zhuǎn)速可能增加剪切力，影響菌絲生長(zhǎng)和代謝，不利于產(chǎn)酶。因此選擇搖床轉(zhuǎn)速范圍為200～230 r/min。

圖1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)纖維素酶活力的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)纖維素酶活力的影響

發(fā)酵溫度對(duì)纖維素酶活力的影響結(jié)果如圖2所示，纖維素酶活力隨著溫度的遞增而呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，32℃時(shí)酶活力最高，是因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)代謝和產(chǎn)物合成都需要在合適的溫度下進(jìn)行，在發(fā)酵過(guò)程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。溫度的變化不僅影響微生物體內(nèi)許多生化反應(yīng)類(lèi)型，也影響微生物細(xì)胞中生化反應(yīng)的速度。不同微生物都有自己適宜的生長(zhǎng)溫度范圍，溫度不同代謝產(chǎn)物的合成與積累也會(huì)有所不同。因此選擇30～33℃為后續(xù)試驗(yàn)培養(yǎng)溫度范圍。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)纖維素酶活力的影響

2.1.3 接種量對(duì)纖維素酶活力的影響

分別以接種量為1%、3%、5%、10%、15%的水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定纖維素酶活力，結(jié)果如圖3所示。接種量低于5%時(shí)，纖維素酶活力較低，這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)小，發(fā)酵前期菌體增長(zhǎng)緩慢，增殖時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)影響菌種的活力，不利于產(chǎn)物合成;接種量超過(guò)5%之后，纖維素酶活力有所降低，是因?yàn)榫w過(guò)多導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分不能滿(mǎn)足正常的生長(zhǎng)代謝或溶氧不足從而影響菌體產(chǎn)酶。接種量為5%時(shí)纖維素酶活力最高，因此確定最適接種量為5%。

圖3 接種量對(duì)纖維素酶活力的影響

2.1.4 初始pH對(duì)纖維素酶活力的影響

初始pH對(duì)纖維素酶活力的影響如圖4所示，纖維素酶活力在初始pH 4.0～6.0之間有較高的酶活，當(dāng)初始pH為5.0時(shí)酶活最高，這是因?yàn)槌跏紁H不僅對(duì)微生物的生長(zhǎng)有影響，還會(huì)影響到代謝產(chǎn)物的形成，從而影響纖維素酶的活力。pH影響微生物細(xì)胞原生質(zhì)膜的電荷進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的滲漏，同時(shí)還會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解進(jìn)而影響到代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此選擇初始pH 4.5～5.5為最佳初始pH范圍。

圖4 初始pH對(duì)纖維素酶活力的影響

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響

在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，每隔12 h分別取樣測(cè)定酶活。發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響結(jié)果如圖5所示，在0～48 h，纖維素酶活力增長(zhǎng)緩慢;隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酶活逐漸升高，在144 h酶活達(dá)到最高，隨后酶活呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榍嗝估w維素酶是一類(lèi)胞外酶，在分泌過(guò)程中會(huì)有高峰期存在，酶在高峰期的穩(wěn)定性因培養(yǎng)基的不同而具有較大的差異性，且慢發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)具有很大的影響，需要準(zhǔn)確控制。因此選擇132～144 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間范圍。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響

2.2 Box－Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇搖床轉(zhuǎn)速(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、初始pH(X3)、發(fā)酵時(shí)間(X4)為影響因素，采用Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1～表2所示。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)因素與水平

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SAS8.1對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表3所示，模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.961 0，表明該模型擬合程度較好。所得二次回歸擬合方程為:

Y=135.52+1.45X1+0.24X2+1.51X3+0.19X4－4.86X1X1+1.14X1X2+4.74X1X3+3.08X1X4－4.94X2X2+5.43X2X3+0.08X2X4－ 4.92X3X3+0.07X3X4－4.76X4X4

對(duì)回歸方程求解并修整，得到各因素最佳值分別是:發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間142 h、初始pH 5.2、轉(zhuǎn)速230 r/min，纖維素酶的酶活達(dá)到理論最大值136.16IU/mL。利用Statistica6.0軟件根據(jù)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪出響應(yīng)面分析圖及其等高線(xiàn)，如圖6所示，X1與X3，X1與X4，X2與X3交互影響明顯，即發(fā)酵溫度與初始pH、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速與初始pH交互效應(yīng)顯著。

圖6 兩因素交互影響纖維素酶活力的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述優(yōu)化的Penicillium sp.1407發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，即發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間142 h、初始 pH 5.2、轉(zhuǎn)速230 r/min，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得纖維素酶活為(136±0.74)IU/mL，與擬合回歸方程最佳預(yù)測(cè)值相比誤差為0.54%，說(shuō)明回歸模型真實(shí)可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和Box－Benhnken試驗(yàn)對(duì)Penicillium sp.1407產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。獲得最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間142 h、初始pH 5.2、轉(zhuǎn)速230 r/min，在該條件下，纖維素酶活可達(dá)(136 ±0.74)IU/mL，較優(yōu)化前提高了17.73%。

纖維素酶應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品深加工及副產(chǎn)品綜合利用，可提高農(nóng)副產(chǎn)物的附加值。但是目前纖維素酶的生產(chǎn)成本較高，因此從發(fā)酵水平提高纖維素酶活具有重要的意義，本研究可為進(jìn)一步放大發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶提供理論依據(jù)。

［1］蘇麗萍，馬雙青，韓增祥，等.復(fù)合纖維素酶制劑對(duì)育肥羊的增重效果［J］.飼料工業(yè)，2012，33(12)47－49

［2］陳興，毛慧玲，王佳堃，等.外源纖維素酶制劑對(duì)青貯玉米體外發(fā)酵特性以及甲烷生成的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25(1):214 －221

［3］林燕，張偉.一種采用秸稈類(lèi)木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇的工藝［P］.中國(guó)專(zhuān)利:CN102517341，2012－6－27

［4］徐忠，楊雪欣，汪群彗，等.大豆秸稈酶水解的影響因素的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19(5):51－54

［5］魏義勇，李珺.水酶法提取濕磨法玉米胚芽油的研究［J］.中國(guó)油脂，2005，30(8):17 －19

［6］章紹兵，王璋.水酶法提取菜籽乳化油的工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(11):250 －253

［7］祖亭月，何美瑩，張連富.水酶法提取橡膠籽油的工藝研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28(2):37 －42

［8］Dan P，Zhoulin L，Chuling G，et al.Application of cellulase for the modification of corn stalk:leading to oil sorption［J］.Bioresource Technology，2013，137:414 －418

［9］Phitsuwan P，Laohakunjit N，Kerdchoechuen O，et al.Present and potential applications of cellulases in agriculture，biotechnology and bioenergy［J］.Folia Microbiological，2013，58(2):163－176

［10］杜翠嬌，任河，杜建敏，等.纖維素酶及其應(yīng)用［J］.食品工程，2011，(2):6－7

［11］王儀明，張宗舟，藺海明，等.灰綠青霉固態(tài)發(fā)酵秸稈產(chǎn)纖維素酶的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(4):141－146

［12］王倩.青霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究［D］.太原:太原理工大學(xué)，2010

［13］許玉林，鄭月霞，葉冰瑩，等.一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2013，40(2):220 －227.