周紅霞，杜丹丹，王穎，李慧素，吳寧鵬?

（1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008；2.鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司，鄭州450000）

12種獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢查方法的建立

周紅霞1，杜丹丹2，王穎2，李慧素1，吳寧鵬1?

（1.河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008；2.鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司，鄭州450000）

采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（73∶27，V／V）為流動相，建立了測定12種獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對照品比對方法，對非法添加藥物進行確證。在此液相條件下，對7種獸藥粉散劑和5種注射液藥物，進行添加回收試驗和檢測限的測定。結果顯示，甲氧芐啶在粉劑中三個濃度（1%、5%、10%）添加回收率為74.6%～115.0%，RSD為0.1%～7.6%，在注射液中三個濃度（0.5%、1%、2%）的添加回收率為87.0%～119.7%，RSD為0.9%～4.1%。甲氧芐啶在各制劑中的檢測限為0.5 mg／g（0.25 mg／mL）。改變試驗條件后對峰純度指示、光譜相似度進行考察，仍能滿足要求。

甲氧芐啶；峰純度檢查；光譜相似度檢查；高效液相色譜－二極管陣列檢測

甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP）是一種常用抗菌藥，對多種革蘭氏陽性和陰性細菌有抗菌作用，有抑制二氫葉酸還原酶的作用，為磺胺增效劑，主要與磺胺類制劑組成復方制劑，用于擴大抗菌譜，增強抗菌活性，在臨床上廣泛應用［1］。一些不法企業(yè)常違規(guī)在其他藥劑中添加甲氧芐啶，以得到增效作用，實際上不但沒有起到增效作用，反而會使動物產生耐藥性，同時，長期大劑量的使用本品會對動物產生致畸作用，其在動物體內的殘留，也會給人類的健康帶來危害［2］。為了打擊非法添加行為，為使用過程中甲氧芐啶的監(jiān)控提供可靠依據，建立獸藥中非法添加甲氧芐啶的檢查方法，顯得尤為重要。農業(yè)部公告2508號公布了僅硫酸慶大霉素注射液一種制劑中非法添加甲氧芐啶的檢查方法［3］，本研究建立了鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、磷酸泰樂菌素預混劑、替米考星預混劑及喹諾酮類制劑等共12種獸藥制劑中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對照品來源 甲氧芐啶對照品，含量100.0%，批號H0160704，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 樣品來源 鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、磷酸泰樂菌素預混劑、替米考星預混劑、喹諾酮類制劑等12種制劑，均來市售產品，經檢測均不含甲氧芐啶。

1.1.3 試劑 甲醇，色譜純；磷酸二氫鉀，分析純；純化水，實驗室MILLIPORE超純水儀自制。

1.1.4 儀器設備 高效液相色譜儀（Waters2695，PDA，Empower2色譜工作站軟件）；MILIPORE超純水器；METTLER XP205電子分析天平；超聲波清洗器：KQ－3200E型；1 mL注射器。

1.2 方法

1.2.1 陰性空白溶液配制 精密稱?。咳。╆幮詷悠芳s1.0 g（或2.0 mL），置50 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲10 min，靜置，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取甲氧芐啶對照品25 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得到500 μg／mL的標準儲備液，精密量取標準儲備液，用流動相分別稀釋制成1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg／mL的標準系列工作溶液，置4℃冰箱中保存。

1.2.3 色譜條件 參照文獻［4］色譜柱Waters Xbridge C18（4.6×150 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀（27∶73）；二極管陣列（PDA）檢測器，采集波長范圍為200～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄270 nm波長處的色譜圖；柱溫30℃；進樣量10 μL。

1.2.4 標準曲線 按照1.2.3項色譜條件，依法測定1.2.2項下系列標準工作溶液，以峰面積（y）對濃度（x）進行線性回歸。

1.2.5 回收率試驗 參照文獻［5］精密稱取甲氧芐啶原料10、50、100 mg各3份，分別置50 mL容量瓶中，加入1 g供試品，混勻，加適量流動相溶解，超聲約10 min，靜置，定容至刻度；從上述溶液中精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相稀釋，定容搖勻，得相當于甲氧芐啶20、100、200 μg／mL濃度添加水平的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.3項下液相條件記錄色譜圖。（粉劑及預混劑按照上述方法操作，注射液略有不同，各取2 mL空白注射液制劑，甲氧芐啶原料添加量為10、20、40 mg各3份，得相當于甲氧芐啶20、40、80 μg／mL濃度的3個添加水平，其他操作相同。）

1.2.6 專屬性試驗 按1.2.3項下色譜條件，分別對甲氧芐啶對照品溶液、供試品（添加甲氧芐啶）溶液和陰性空白溶液進行測定。

1.2.7 檢測限 精密稱取制劑1 g（或精密量取注射液2 mL），分別精密加入1.2.2項下的甲氧芐啶對照品溶液適量，制成系列添加濃度0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg／mL。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.3項下液相條件記錄色譜圖。依法測定。光譜圖失真前的濃度為該測試藥物的檢測限［6］。

1.2.8 耐用性試驗 改變柱溫為25、30、35℃；改變流動相比例分別為80∶20、75∶25、70∶30；改變流速分別為0.4、0.6、0.8 mL／min；選擇不同品牌色譜柱（Waters SunfireTMC18（4.6×250 mm，5 μm）；Agilent XORBA SB－C18（3.0×250 mm，5 μm）；SHIMADZU VP（4.6×150 mm，5 μm）；Waters Xbridge C18（4.6×150 mm，5 μm），對其峰型、分離度、峰純度指示、出峰時間進行考察。

2 結果與分析

2.1 峰純度檢查 對供試品溶液色譜圖中甲氧芐啶峰進行峰純度檢查［6］，結果見圖1、圖2。結果顯示，甲氧芐啶的純度角度小于純度閾值（圖2、表1），表明在此液相條件下，甲氧芐啶的出峰處無其他干擾峰，為單一物質峰，方法可行。

圖1 供試品（磷酸泰樂菌素預混劑）添加甲氧芐啶光譜圖及色譜圖

圖2 供試品（磷酸泰樂菌素預混劑）添加甲氧芐啶純度檢查圖

2.2 光譜相似度檢查 對供試品溶液中甲氧芐啶的光譜圖與光譜庫進行匹配，匹配角度小于匹配閾值（表1），表明供試品溶液中相應色譜峰的光譜與甲氧芐啶對照品的光譜非常相似，可認為是同一物質。

2.3 專屬性考察 通過供試品空白試驗排除對于被測物的干擾，以甲磺酸培氟沙星可溶性粉為例，結果表明在甲氧芐啶出峰處無干擾（圖3、圖4）。

表1 峰純度檢查結果表

圖3 添加樣品色譜圖

圖4 空白基質（樣品和試劑）色譜圖

同時，峰純度檢查結果顯示在此液相條件下，甲氧芐啶為單一物質峰。峰純度檢查：甲氧芐啶色譜峰光譜均勻，純度較高，可認為單一物質。光譜相似度檢查：供試品溶液甲氧芐啶色譜峰與光譜圖中甲氧芐啶對照品的光譜匹配。

2.4 標準曲線與線性范圍 將1.2.2項中標準系列工作液進行測定，以峰面積（y）對濃度（x）進行線性回歸，甲氧芐啶的回歸方程Y＝21525X＋3002.8和相關系數(shù)r為0.9999。結果表明：甲氧芐啶在1～500 μg／mL的濃度范圍內線性關系良好。

2.5 回收率試驗 考慮到本試驗中甲氧芐啶對照品使用量較大，本試驗用符合純度要求的獸藥原料藥代替對照品進行添加試驗，即在陰性空白樣中分別添加甲氧芐啶原料藥，共添加3個濃度，通過試驗結果獲得回收率及相對標準偏差。該方法中粉劑、預混劑中添加甲氧芐啶的回收率為74.6%～115.0%，RSD為0.1%～7.6%；注射液中添加甲氧芐啶的回收率為87.0%～119.7%，RSD為0.9%～4.1%。說明該檢測方法可靠，添加回收結果見表2、表3。

表2 獸藥粉劑、預混劑中添加甲氧芐啶回收率試驗結果

表3 獸藥注射液中添加甲氧芐啶回收率試驗結果

2.6 檢測限 綜合考慮色譜圖峰型、峰面積和甲氧芐啶有效濃度等因素，結果表明，濃度為0.5 μg／mL，光譜圖失真；濃度為1 μg／mL，光譜圖不失真。以光譜圖失真前的濃度作為方法的檢測限，供試品中甲氧芐啶的檢測限分別為0.5 mg／g（粉散劑）、0.25 mg／mL（注射液）（圖5）。

圖5 添加甲氧芐啶濃度為1 μg／mL的光譜圖及色譜圖

2.7 耐用性 柱溫、流動相比例、流速、色譜柱的改變對分離度、峰純度指示、光譜相似度的考察結果顯示，能夠滿足要求，只是保留時間變化。甲氧芐啶保留時間受柱溫影響較小，隨柱溫升高，保留時間略提前；結果顯示隨流動相有機相比例的增加，甲氧芐啶保留時間縮短；隨著流速的增加，保留時間明顯提前；4款不同品牌色譜柱均可用于該檢查，僅保留時間不同，方法耐用性較好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 利用二極管陣列檢測器，在200～400 nm波長范圍內進行紫外吸收圖譜掃描，甲氧芐啶在203、270 nm波長處有最大吸收?？紤]到200 nm附近有“末端吸收”，而且在液相色譜分離中常用的溶劑如甲醇、乙腈等在此波長下有紫外吸收；對本文所選的12種獸藥制劑進行紫外掃描發(fā)現(xiàn)，在270 nm附近均不會產生干擾作用，故選擇270 nm為測定波長。

3.2 流動相的選擇 相關文獻資料報道［3，7－9］使用的流動相有：乙腈－0.0174 mol／L磷酸溶液（20∶80），甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（30∶70），甲醇－0.1 mol／L磷酸二氫鉀溶液（pH為2.5）（30∶70），考慮甲氧芐啶的穩(wěn)定性、出峰時間是否漂移、峰型是否對稱等，含有磷酸溶液的流動相，甲氧芐啶主峰隨著時間的延長向前漂移，不穩(wěn)定，最終確定流動相為甲醇：0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液，并對流動相比例進行考察，以出峰時間、色譜峰寬以及干擾基質的分離情況等作為考察點，通過試驗，最終確定流動相比例為甲醇－0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（27∶73）。

3.3 稀釋液的選擇 參考《中華人民共和國獸藥典》（2010年版）甲氧芐啶的測定方法，根據甲氧芐啶的溶解性：在三氯甲烷中略溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中幾乎不溶，在冰醋酸中易溶解［10］，本次試驗比較了多種稀釋液溶劑系，發(fā)現(xiàn)乙腈、甲醇、不同比例的甲醇水和乙腈水、流動相進行溶解時，采用流動相進行稀釋，甲氧芐啶峰型對稱，無雜質峰的干擾，最終確定流動相為溶媒。

3.4 回收試驗的影響因素 本試驗中，乳酸諾氟沙星可溶性粉的添加濃度為10%時，回收率相對偏低，其主要原因是樣品處理過程中采用超聲溶解，會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可能使得目標分析物沒有完全地溶解，從而造成回收率偏低。煙酸諾氟沙星注射液的添加濃度為0.5%時，回收率相對偏高，最高可達119.7%，主要原因可能為稱樣量較小（10 mg左右），天平讀數(shù)波動較大，造成回收率結果偏高。

歐洲聯(lián)盟對于動物性食品中獸藥的使用有著嚴格的調節(jié)控制，對抗生素、促生長劑、抗菌藥物（如甲氧芐啶）等獸藥的最大殘留量進行檢測和控制時，采用高效液相－串聯(lián)質譜技術（LC－MS）［11－12］對抗菌藥物中甲氧芐啶進行測定。我國農業(yè)部公告2508號中對11個獸藥非法添加化學藥物的檢測方法［3］，采用高效液相色譜法（HPLC－UV）對甲氧芐啶進行測定。本研究建立的對12種制劑中非法添加甲氧芐啶藥物的檢測方法，為國內首個建立的對甲氧芐啶藥物監(jiān)測的HPLC－PDA法，該方法操作簡便，具有高效高分離度的特點，具有很高的參考應用價值。

4 結論

本試驗采用高效液相色譜法結合二極管陣列檢測器，通過對稀釋液、波長以及流動相的考察，建立了獸藥中非法添加甲氧芐啶的HPLC－PDA檢測方法，該檢測方法實現(xiàn)了添加藥物與其他物質峰的色譜分離，經峰純度檢查確保添加藥物出峰處無干擾，同時該方法較穩(wěn)定、準確、重現(xiàn)性好，可用于其他獸藥中非法添加甲氧芐啶的檢測，具有較高的實用價值。

［1］ 王葒暉.中成藥非法添加化學藥物研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（9）：1168.

［2］ 宋慧敏，畢昊容，邵德佳，等.獸藥粉劑／預混劑中甲氧芐啶的測定［J］.中國獸藥雜志，2007，41（1）：33－35.

［3］ 中華人民共和國農業(yè)部公告第2508號.硫酸慶大霉素注射液中非法添加甲氧芐啶檢查方法［S］.

［4］ 郭時金，沈志強，張志美，等.HPLC法檢測磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶方法的研究［J］.家畜生態(tài)學報，2010，31（4）：73－76.

［5］ 高秀蕊，王秀萍.HPLC測定復方頭孢氨芐中的頭孢氨芐和甲氧芐啶含量方法的改進［J］.中國抗生素雜志，2004，29（11）：694－696.

［6］ 董玲玲，范強.氟苯尼考粉中非法添加煙酰胺和氨茶堿的HPLC－PDA檢測方法的建立［J］.中國獸藥雜志，2014，48（5）：47－50.

［7］ 岳莉，趙萬晴.高效液相色譜法測定甲氧芐啶片的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14（3）：288－289.

［8］ 王寶佳，邱洪，王福蘭，等.高效液相色譜法測定復方四環(huán)素片中甲氧芐啶含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17（21）：29－30.

［9］ 朱曉華，翁棋蘭，王靜，等.高效液相色譜同時檢測魚肉組織中4種磺胺與甲氧芐啶的殘留量［J］.南京農業(yè)大學學報，2009，32（4）：138－142.

［10］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（一部）［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2010.

［11］A.A.M.Stolker，T.Zuidema，M.W.F Nielen.Residue analysis of veterinary drugs and growth－promoting agents［J］.Trends in Analytical Chemistry，2007，26（10）：967－979.

［12］Lglesias A.Detection and quantitative analysis of 21 veterinary drugs in river water ueing high－pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry［J］.Envion Sci PollutRes Int，2012，19（8）：3235－3249.

（編輯：侯向輝）

Determination of Trimethoprim in the 12 Kinds of Verterinary Drugs by HPLC－PDA

ZHOU Hong－xia1，DU Dan－dan2，WANG Ying2，LI Hui－su1，WU Ning－peng1?
（1.Henan Institute of Veterinary Drug Control，Zhengzhou 450008，China；2.Zhengzhou Bairui Animal Pharmaceutical Co Ltd，Zhengzhou 450000，China）

C18 column was used，mobile phase was phosphate buffer and methnol（73∶27，V／V），and established a method for determination of trimethoprim in the 12 kinds of veterinary drugs by HPLC－PDA.Peak purity test and spectrum similar test were helped to identify the trimethoprim.Under this liquid condition，the test of added recycling，the determination of detection limit were operated.Results showed that the added recycling rate of TMP in the veterinary powder under three levels（1%，5%，10%）were 74.6%～115.0%，the RSD were 0.1%～7.6%.and injection under three levels（0.5%，1%，2%）were 87.0%～119.7%，the RSD were 0.9%～4.1%.Detection limit of trimethoprim in the preparation has got by this method was 0.5 mg／g（0.25 mg／mL）.Changing the test conditions，the purity test，spectral similarity can meet the requirements.

trimethoprim；peak purity test；spectrum similar test；HPLC－PDA

2014－07－28

A

1002－1280（2014）11－0043－06

S859.83

周紅霞，研究員，從事獸藥質量監(jiān)測與監(jiān)督。

吳寧鵬。E－mail：wnppeking2002＠163.com