游元，曾建國(guó)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙410128）

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定蓼博顆粒中4種有效成分的含量

游元，曾建國(guó)?

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙410128）

建立中藥復(fù)方制劑蓼博顆粒中4種有效成分一測(cè)多評(píng)的定量檢測(cè)方法，以用于質(zhì)量評(píng)價(jià)。以血根堿為內(nèi)參物，建立白屈菜紅堿、沒食子酸與穿心蓮內(nèi)酯的相對(duì)校正因子，利用校正因子計(jì)算白屈菜紅堿、沒食子酸與穿心蓮內(nèi)酯的含量，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)；同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定以上4種成分的含量，比較兩種方法的差異，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。蓼博顆粒中4種成分含量的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值無顯著差異。表明建立的只用1種對(duì)照品同時(shí)測(cè)定蓼博顆粒中4種有效成分的方法準(zhǔn)確、可行，適合中藥的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式的要求。

高效液相色譜法；蓼博顆粒；一測(cè)多評(píng)；血根堿

蓼博顆粒復(fù)方是由辣蓼、穿心蓮、博落回葉和魚腥草四味中藥材經(jīng)提取濃縮而制成的顆粒劑，現(xiàn)代研究表明，蓼博顆粒制劑中含有的沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿，具有抑菌［1－2］、抗炎［3］和抗細(xì)菌性腹瀉［4］的功效?？股匾恢睆V泛用于治療仔豬腹瀉，目前抗生素的濫用以及其殘留對(duì)人體產(chǎn)生的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注［5－7］，蓼博顆粒臨床上旨在替代抗生素用于預(yù)防和治療斷奶仔豬的腹瀉。

本文主要通過一測(cè)多評(píng)法建立蓼博顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。一測(cè)多評(píng)法是指利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測(cè)定一個(gè)成分（對(duì)照品可得到者）實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品難以得到或難供應(yīng)）的同步測(cè)定。近年來關(guān)于一測(cè)多評(píng)的研究思路和方法在多種藥材或飲片中多個(gè)成分的測(cè)定中得到了驗(yàn)證［8－10］。采用常規(guī)的外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法建立蓼博顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要4種對(duì)照品，有些對(duì)照品缺乏，即使有對(duì)照品，價(jià)格也昂貴，而采用一測(cè)多評(píng)法可以解決常規(guī)方法在復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的不足。本文采用一測(cè)多評(píng)法以克服這一難題，即只使用一種對(duì)照品，通過引入相對(duì)校正因子，實(shí)現(xiàn)其它待測(cè)成分的測(cè)定，達(dá)到了用單一對(duì)照品對(duì)蓼博顆粒制劑多指標(biāo)的質(zhì)量控制的目的。對(duì)蓼博顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260 Series高效液相色譜儀，島津LC20－30V高效液相色譜儀；AE240型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（HERMLE 2323K，德國(guó)）；DHG－9246A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。色譜柱：Welth Ultimate XB－C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），華普XCharge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和KromasilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 藥品與試劑 沒食子酸對(duì)照品來源為中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831－201204，含量為89.9%；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品來源為中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110797－201108，含量為98.7%；鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對(duì)照品由湖南美可達(dá)生物資源有限公司提供，批號(hào)分別是S20091001和100820，含量均大于98.0%；蓼博顆粒，批號(hào)：20130511、20130512、20130513、20130514、20130515、20140709、20140710、20140711、20140712和20140713，湖南美可達(dá)生物資源有限公司在研產(chǎn)品；水為Milli－Q超純水；甲醇（色譜純，Merck）；其他試劑均為分析純。

1.3 高效液相色譜條件 采用Welth Ultimate XBC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液（A）與甲醇（B），流速為0.8 mL／min，洗脫梯度為：0～10 min，12%B；10～11 min，12%～40%B；11～30 min，40%～70%B；30～40 min，70%～95%B；40～45 min，95%B；45～45.1 min，95%～12%B；45.1～50 min，12%B。柱溫25℃，進(jìn)樣量5 μL。血根堿、白屈菜紅堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸對(duì)照品約15 mg，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品約5 mg，鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.15 mg／mL沒食子酸、0.05 mg／mL穿心蓮內(nèi)酯和0.10 mg／mL血根堿與白屈菜紅堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含沒食子酸0.03 mg、穿心蓮內(nèi)酯0.01 mg、鹽酸血根堿0.02 mg和鹽酸白屈菜紅堿0.02 mg的混合對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 取蓼博顆粒樣品1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－1.0%的鹽酸溶液100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理60 min，取出，放冷，稱定重量，用甲醇－1.0%的鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，取上清液置10 mL離心管中，13500 r／min離心10 min，取上清液，用0.45 μm的濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1－圖7。陰性對(duì)照在相應(yīng)位置處未見色譜峰，方法專屬性良好。

圖1 對(duì)照品溶液（225 nm）的高效液相色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液（274 nm）的高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液（225 nm）的高效液相色譜圖

圖4 供試品溶液（274 nm）的高效液相色譜圖

圖5 缺博落回葉陰性樣品（274 nm）的高效液相色譜圖

圖6 缺穿心蓮陰性樣品（225 nm）的高效液相色譜圖

圖7 缺辣蓼陰性樣品（225 nm）的高效液相色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、6和8 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件分析，分別以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸，求得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 蓼博顆粒4種有效成分的線性關(guān)系和范圍

2.3 相對(duì)校正因子計(jì)算 以血根堿為內(nèi)參物，參照公式fkm＝fk／fm＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）［11］，fkm為校正因子；式中Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wk為內(nèi)參物k的濃度；Am為待測(cè)組分m的峰面積；Wm為待測(cè)組分m的濃度。按“1.3”項(xiàng)下色譜條件，考察不同濃度對(duì)照品對(duì)fkm的影響。按“2.3”項(xiàng)下公式計(jì)算，結(jié)果見表2。

2.4 不同高效液相色譜儀與色譜柱上相對(duì)校正因子的考察 取“1.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件，“2.3”項(xiàng)下計(jì)算鹽酸血根堿對(duì)鹽酸白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的校正因子。在Agilent1260 Series和島津LC20－30V高效液相色譜儀系統(tǒng)上考察了不同品牌的3根色譜柱，見表3。

表2 血根堿對(duì)白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的校正因子

表3 不同色譜儀及不同色譜柱的校正因子（n＝3）

2.5 待測(cè)組分色譜峰的定位 利用相對(duì)保留值（rk／s）定位，rk／s按下式計(jì)算：rk／s＝tR（k）／tR（s）（k為其它組分，s為內(nèi)參物）。再根據(jù)峰形判斷，即能夠準(zhǔn)確確定目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置，結(jié)果見表4。由表4可知，RSD＜5%，表明利用rk／s進(jìn)行色譜峰定位是可行的。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿的峰面積，峰面積的RSD分別為0.20%、0.12%、0.18%和0.17%，表明在此方法下儀器精密度符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μL，分別于配制后的0、2、4、6、12、24、48 h測(cè)定，沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為0.19%、0.28%、0.34%和0.23%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20130513的樣品，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別測(cè)定沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿的含量，測(cè)得含量的RSD分別為0.23%、0.29%、0.17%和0.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的蓼博顆粒樣品（批號(hào)：20130513），每份1 g，置200 mL的量瓶中，分別精密加入80%、100%、120%含量的沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、鹽酸血根堿和鹽酸白屈菜紅堿對(duì)照品，混合均勻，作為添加樣品，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，沒食子酸、穿心蓮內(nèi)酯、血根堿和白屈菜紅堿的回收率分別為99.46%、98.02%、99.27%和97.85%，RSD依次為1.03%、1.29%、1.37%和0.97%。

2.10 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 分別精密吸取不同批次樣品供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀，記錄血根堿、白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算其含量，結(jié)果見表5。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法得到的蓼博顆粒中血根堿、白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯含量進(jìn)行比較，結(jié)果（P＞0.05）表明兩種方法測(cè)得的含量沒有顯著性差異。

表5 不同方法對(duì)蓼博顆粒中4中有效成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）mg／g

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品前處理方法的選擇 本文對(duì)不同的提取方式、提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在提取時(shí)間和提取溶劑相同的條件下超聲法與回流法的提取效果沒有顯著性差異；分別采用10%鹽酸溶液和1%鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑，結(jié)果表明，沒食子酸在兩種溶劑的提取效率沒有差異，在提取血根堿、白屈菜紅堿和穿心蓮內(nèi)酯時(shí)后者的提取效率遠(yuǎn)大于前者；分別對(duì)30、60、150 min的提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果表明，提取時(shí)間60 min與30 min有顯著性差異，而與提取150 min沒有顯著性差異。試驗(yàn)最終確定了“1.4.2”項(xiàng)下的方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯在200～250 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，參照紫外可見分光光度法，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示沒食子酸在225 nm處有最大吸收，穿心蓮內(nèi)酯在232 nm處有最大吸收。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮選擇225 nm作為沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯的檢測(cè)波長(zhǎng)。同樣的方法得到274 nm作為血根堿與白屈菜紅堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。且在一測(cè)多評(píng)法中采用每種成分的最大吸收波長(zhǎng)可以提高在不同儀器下的重復(fù)性。

3.3 內(nèi)參物的選擇 本試驗(yàn)以血根堿為內(nèi)參物，鹽酸血根堿為醇溶性化合物，其鹽的穩(wěn)定性強(qiáng)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其對(duì)照品溶液放置較長(zhǎng)時(shí)間后峰面積沒有變化，在制劑中的含量也較高，因此選擇血根堿為內(nèi)參物對(duì)制劑中的4種成分進(jìn)行測(cè)定，體現(xiàn)了一測(cè)多評(píng)的優(yōu)勢(shì)。

3.4 一測(cè)多評(píng)法色譜峰的定位 復(fù)方制劑中HPLC圖譜的色譜峰較多，一測(cè)多評(píng)法中一個(gè)關(guān)鍵問題是如何準(zhǔn)確定位色譜峰的位置。目前主要有三個(gè)方法：1、色譜法；2、光譜法；3、光譜法與色譜法相結(jié)合。試驗(yàn)中通過使用待測(cè)成分的最大吸收波長(zhǎng)，提高了分析方法的靈敏度和各色譜峰的豐度，且由于目標(biāo)峰位置的雜峰干擾較少，再結(jié)合色譜法的相對(duì)時(shí)間保留值可以判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置。

本試驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)對(duì)蓼博顆粒的四種有效成分進(jìn)行了含量檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)得的含量結(jié)果沒有顯著性差異，可以在缺少白屈菜紅堿、沒食子酸和穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品的情況下，通過校正因子與色譜峰定位計(jì)算其含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蓼博顆粒4種成分的質(zhì)量控制，并對(duì)含有以上成分的其它產(chǎn)品的含量測(cè)定具有一定的參考價(jià)值。

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（編輯：陳希）

Determination of Four Kinds of Effective Components in Compound Liaobo Powder by Multi－component with a Single Maker

YOU Yuan，ZENG Jian－guo?
（Hunan Agricultural University，National and Local Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Changsha 410128，China）

To establish a quantitative analysis method of multi－component by a single maker（QAMS）for the four components quantitative detection in Liaobo powder for its quantitative evaluation.Sanguinarine was used as the reference，the calibration factor of gallic acid，andrographolide and chelerythrine to that of sanguinarine were calculated respectively to get each relative calibration factor and the contents of active constituents were calculated by the relative calibration，and then，the method was set up.At the same time，external standard method was used to detect the contents of the four constituents，the two methods were compared to validate the accuracy and feasibility of the new method.No significate difference were found in the quantitative results of the four active constituents between the measured value and the calculated value.In this study，only one reference substance was used to determination of four effective ingredients in Liaobo powder at the same time.The method is accurate and feasible and suitable for the requirements of the multi－index evaluation model of Chinese traditional medicine.

HPLC；compound Liaobo powder；QAMS；sanguinarine

2014－09－05

A

1002－1280（2014）11－0037－06

S853.73

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD34B02）

游元，碩士研究生，從事功能產(chǎn)品開發(fā)與評(píng)價(jià)。

曾建國(guó)。E－mail：ginkgo＠world－way.net