王全杰，劉洪斌，張智明，王彬，楊鵬欣，竇海燕，孟福強，丁國杰

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069）

兩種滅活方法制備的豬肺炎支原體滅活疫苗的免疫效果比較

王全杰，劉洪斌，張智明，王彬，楊鵬欣，竇海燕，孟福強，丁國杰?

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069）

為對比使用甲醛、二乙烯亞胺（BEI）兩種滅活方法制備的豬肺炎支原體滅活疫苗對豬的呼吸道發(fā)病率、肺部病變記分、飼料轉(zhuǎn)化率、日增重、以及豬血清抗體水平等指標(biāo)的影響，將120頭健康仔豬隨機分成三個試驗組和一個對照組，于7、21日齡對試驗組的仔豬進(jìn)行疫苗接種，所有豬于20、50、80及140日齡采血分離血清，檢測血清中豬肺炎支原體抗體水平。結(jié)果顯示，用BEI滅活的疫苗在呼吸道發(fā)病率、肺部病變記分、飼料轉(zhuǎn)化率、日增重、以及豬血清抗體水平等各項指標(biāo)均好于甲醛滅活的疫苗（P＜0.05），與進(jìn)口疫苗無顯著差異。試驗表明，使用BEI滅活方法制備的豬肺炎支原體滅活疫苗的免疫效果好。

滅活；二乙烯亞胺；甲醛；支原體；免疫效果

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性接觸性呼吸道疾病，俗稱喘氣?。?］。感染豬慢性、持續(xù)干咳，其中育肥前期豬咳嗽最嚴(yán)重。該病能造成豬的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率等生產(chǎn)性能指標(biāo)的明顯下降，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，同時還容易引起其他細(xì)菌病毒的繼發(fā)感染，大幅增加治療費用［2］。

免疫接種豬肺炎支原體疫苗是防控該病的重要手段之一，接種疫苗可減少肺部損傷，提高料肉比及縮短出欄時間［3］。目前，豬支原體肺炎疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗，由于弱毒疫苗需要胸腔接種，操作困難，所以不易于推廣普及。滅活疫苗通過肌肉注射進(jìn)行接種，易于操作，同時生產(chǎn)工藝簡單、使用安全、方便、易于保存，并能刺激動物產(chǎn)生高滴度抗體和顯著的免疫保護(hù)效果［4］。在滅活疫苗的研制中，用到最多的滅活劑是甲醛，甲醛是比較傳統(tǒng)的滅活劑，其主要通過對蛋白和核酸的烷化作用，使病毒喪失感染性［5］。二乙烯亞胺（BEI）是另一類良好的病毒滅活劑，其作用原理是破壞微生物核酸，而不影響其蛋白質(zhì)成分，并保持病毒抗原性［6］。本實驗分別用BEI和甲醛對豬肺炎支原體進(jìn)行滅活并制備成疫苗，并設(shè)立進(jìn)口疫苗作為對照，通過動物試驗，比較兩種滅活疫苗對支原體肺炎的抵抗能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 1日齡健康杜長大三元雜交仔豬120頭（支原體肺炎母源抗體為陰性），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實驗動物中心提供。

1.1.2 供試抗原及疫苗 豬肺炎支原體P－5722－3菌株抗原由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司提供，豬支原體肺炎滅活疫苗（進(jìn)口）由美國輝瑞公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑 二乙烯亞胺（BEI），購自FLUCA公司；硫代硫酸鈉購自Alfa公司，甲醛，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒，由美國IDEXX公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 滅活疫苗的制備 將檢驗合格的菌液（抗原濃度≥108CCU／mL）分成兩組。第一組為BEI滅活組，向菌液中加入BEI溶液至終濃度4‰，（37±2）℃下攪拌培養(yǎng)至少24 h。加入硫代硫酸鹽溶液（最終濃度4 mmol／L），繼續(xù)攪拌至少24 h［7］；第二組為甲醛滅活組，向菌液中緩慢加入甲醛溶液至終濃度2‰，（37±2）℃下滅活至少24 h。半成品檢驗合格后，用磷酸緩沖鹽水調(diào)整抗原濃度，并調(diào)pH至7.0±0.2，加入佐劑后乳化。

1.2.2 試驗分組 將試驗動物隨機分成4組，30頭／組，A組為BEI滅活疫苗組，B組為甲醛滅活疫苗組，C組為進(jìn)口疫苗組，D組為空白對照組。A、B、C組分別于7、21日齡進(jìn)行疫苗免疫，肌肉注射，2 mL／頭，D組注射同樣劑量的生理鹽水。所有試驗豬按照常規(guī)飼養(yǎng)進(jìn)行管理，仔豬于28日齡斷奶，70日齡轉(zhuǎn)入育肥舍。

1.2.3 觀察指標(biāo)

1.2.3.1 生產(chǎn)性能指標(biāo) 注射疫苗后，分別于28、70、155、180 d稱量豬體重，并記錄飼養(yǎng)各個階段飼料使用情況。計算并比較各組的日增重及料肉比情況。

1.2.3.2 發(fā)病情況統(tǒng)計 在飼養(yǎng)的全程記錄試驗豬的發(fā)病情況，計算呼吸道發(fā)病率。

同時，在75日齡時，每組隨機抽取10頭豬進(jìn)行宰殺，觀察和記錄每頭豬的肺臟病變情況，通過55分法［8］記分，計算肺炎減少率。

1.2.3.3 抗體檢測 每組隨機抽取10頭試驗豬，分別于20、50、80、140日齡通過前腔靜脈采血并分離血清，按照ELISA抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測，在波長為650 nm處測量和記錄樣品和對照的吸光度值。檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)［9］：S／P＜0.3為陰性，S／P＞0.4為陽性，0.3≤S／P≤0.4為可疑。

2 結(jié)果

2.1 豬生長各階段平均體重及生產(chǎn)性能試驗結(jié)果仔豬分別于出生后7日齡和21日齡兩次免疫豬氣喘病疫苗，接種后免疫仔豬均無過敏反應(yīng)，沒有的臨床異常反應(yīng)，注射部位無腫塊和異常反應(yīng)。表明兩種滅活疫苗對仔豬安全性良好。豬生長各階段的平均體重見表1。

表1 豬生長各階段平均體重情況表

根據(jù)表1中的體重情況，計算出豬生長各階段的日增重及料肉比，結(jié)果見表2。由表2可以看出，在哺乳期內(nèi)（0～28 d）所有豬日增重相差不大；哺乳期至出欄前，A組日增重均大于B組和D組，A組與C組日增重差異不大。A組和C組飼料轉(zhuǎn)化率高于B組和D組。從全程來看，A組的平均日增重為554.9 g，B組的平均日增重為540.4 g，C組的平均日增重為549.11 g，D組平均日增重為465.9 g，A組與D組差異顯著（P＜0.05），與C組差異不顯著。D組料肉比為3.07，C組料肉比為2.68，B組料肉比為2.83，A組料肉比為2.63，A組較B組降低0.20，與C組料肉比相當(dāng)，由此可見，BEI滅活疫苗組免疫豬經(jīng)濟(jì)效益較甲醛滅活組免疫豬要好。

表2 豬生長各階段的生產(chǎn)性能檢測結(jié)果

2.2 試驗豬的呼吸道發(fā)病率及免疫豬肺炎減少率75日齡時，對照組的豬發(fā)生氣喘性咳嗽，呼吸困難，并有明顯的腹式呼吸，精神不振，免疫組未見上述癥狀，每組隨機抽取10頭豬進(jìn)行宰殺，觀察肺部病變，結(jié)果對照豬出現(xiàn)典型的豬喘氣病肺部病變，在肺臟心葉、尖葉、中間葉以及膈葉前1／3部位，出現(xiàn)大面積胰樣病變，病灶部位切面多汁，豬肺炎記分平均分為14.0；C組免疫豬肺部幾乎沒有病變，豬肺炎記分平均分為2.3，肺炎減少率為83.57%；B組免疫豬肺部病變情況明顯較輕，只有小面積典型病變，豬肺炎記分平均分為6.7，肺炎減少率為59.28%；A組免疫豬肺部僅有少量病變，豬肺炎記分平均分為2.5，肺炎減少率為82.14%，由此可見，A組免疫效果要好于B組。

試驗豬約在120日齡時，每天觀察咳嗽及喘氣情況，10 min／次，連續(xù)觀察21 d。結(jié)果A組和C組免疫豬只有個別幾頭豬發(fā)生氣喘性咳嗽，呼吸道發(fā)病率分別為0.91%和1.02%；B組免疫豬發(fā)生氣喘性咳嗽的頭數(shù)稍稍多些，呼吸道發(fā)病率為1.90%；D組免疫豬發(fā)生氣喘性咳嗽較多，呼吸道發(fā)病率為3.5%。結(jié)果見表3。

表3 免疫豬肺炎減少率及呼吸道發(fā)病率檢測結(jié)果

2.3 試驗豬血清抗體的檢測

2.3.1 各組豬肺炎支原體抗體水平的比較 試驗豬免疫支原體肺炎疫苗后，各組均產(chǎn)生不同水平的抗體，結(jié)果見表4。可以看出，20日齡時，A、B、C三組的抗體水平差異不顯著，各個免疫組與對照組的抗體水平差異不大；50日齡時，免疫組的抗體水平均升高，A組與B組抗體水平差異顯著，A組抗體水平高于C組，但差異不顯著；80日齡時，免疫組的抗體水平開始下降，但A組抗體水平只是略有下降，均高于其他組，A組與B組差異顯著；140日齡時，免疫組抗體水平略有回升，A組與B組抗體水平差異顯著，A組與C組抗體水平相當(dāng)，各個免疫組與對照組的抗體水平差異較大。

表4 試驗豬肺炎支原體抗體水平檢測結(jié)果

2.3.2 豬肺炎支原體抗體陽性率變化規(guī)律 由表5可以看出，7日齡免疫豬肺炎支原體疫苗后，20日齡時，免疫豬均有豬肺炎支原體抗體產(chǎn)生，其中A組和C組陽轉(zhuǎn)率較高；50日齡時，由于二次免疫的作用，各個免疫組的陽性率快速上升，但是相對于A組和C組，B組抗體陽性率較低；80日齡時，免疫組抗體陽性率下降，A組的陽性率由80%下降到70%，B組的陽性率由40%下降到30%。A組和C組的陽性率差異不顯著；140日齡時，所有試驗組的陽性率均上升。A組和C組的陽性率明顯高于B組和D組。

表5 各組豬血清抗體陽性率統(tǒng)計結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 生產(chǎn)性能比較 為了更好的了解不同滅活方法對豬肺炎支原體滅活的影響，本實驗用BEI和甲醛兩種滅活方法制備的豬肺炎支原體滅活疫苗通過動物試驗進(jìn)行免疫原性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BEI滅活組免疫豬的日增重、飼料轉(zhuǎn)化率和肺部病變減少率均好于甲醛滅活組免疫豬，和進(jìn)口疫苗組的免疫效果差異不顯著?？瞻讓φ战M在70 d后，日增重逐漸減少，同時大部分豬出現(xiàn)氣喘性咳嗽，并出現(xiàn)腹式呼吸。甲醛滅活組個別免疫豬出現(xiàn)同樣的癥狀。但是BEI滅活組和進(jìn)口疫苗組均健康存活。這一結(jié)果與曹建國等［10］研究的結(jié)果相一致。對所有試驗組呼吸道發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計，BEI滅活組和進(jìn)口疫苗組的呼吸道發(fā)病率低于甲醛滅活組，且與空白對照組差異顯著。通過55分法記分比較肺部病變，結(jié)果BEI滅活組肺炎減少率在80%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出甲醛滅活組的59.28%，由此可見，用BEI滅活的疫苗比用甲醛滅活的疫苗對豬的保護(hù)效果要好，能很好的抵御豬肺炎支原體的侵襲。

3.2 抗體水平比較 在豬肺炎支原體免疫保護(hù)方面主要是以細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力為主［11］，但體液免疫力和粘膜免疫力也參與其中，值得一提的是，疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平和阻止病原移行及疾病發(fā)生之間聯(lián)系不大，疫苗抗體水平不一定與保護(hù)正相關(guān)，只為參考性指標(biāo)［12］。本研究對免疫豬生長過程中各個階段的抗體水平和抗體陽性率等指標(biāo)進(jìn)行了跟蹤記錄，在20日齡時，所有試驗豬的抗體水平均較低，并且差異不顯著，這可能表明，在7日齡時注射的疫苗在此時還未能刺激機體產(chǎn)生較高濃度的抗體水平，這一試驗結(jié)果與Villsrreal等［13］報道的豬在接種疫苗3周后可檢測到抗體的結(jié)果相似。從抗體水平和陽性率的數(shù)值上來看，BEI滅活組和進(jìn)口疫苗組的抗體產(chǎn)生差異不顯著，均高于甲醛滅活組，并且甲醛滅活組的陽性率處于很低的水平，主要原因在于甲醛作用于病毒的表面蛋白，使病毒抗原的免疫原性降低，并阻礙其對病毒內(nèi)部核酸的破壞作用［14］，而BEI主要破壞病毒的核酸，使病毒完全喪失感染力，而不損壞病毒的蛋白質(zhì)衣殼，從而保留其保護(hù)性抗原，病毒的免疫原性幾乎不被破壞［15］。

綜上所述，BEI滅活法制備的豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果及經(jīng)濟(jì)效益要好于甲醛滅活法。

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（編輯：李文平）

Comparive Analysis of the Immune Effects of Inactivated Mycoplasma hyopneumoniae Vaccines with Two Perparation Methods

WANG Quan－jie，LIU Hong－bin，ZHANG Zhi－ming，WANG Bin，YANG Peng－xin，DOU Hai－yan，MENG Fu－qiang，DING Guo－jie?
（Harbin Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Biological Vaccine，Harbin 150069，China）

The immune effects of two inactivated Mycoplasma hyopneumoniae vaccines prepared with formaldehyde and ethylene imine（BEI）were compared respectively，including incidence of respiratory disease，lung lesion score，daily weight gain，feed efficiency ratio and porcine serum antibody levels.120 healthy piglets were randomly divided into three experimental groups and a control group.The piglets in experimental groups were vaccinated at the age of 7 and 21 days.At 20，50，80 and 140 days of age，we separated blood serum of all pigs，and detected the antibody level of Mycoplasma pneumonia in serum.Results showed that，BEI inactivated vaccine do better than the formalin inactivated vaccine in the aspects of respiratory morbidity，lung lesion score，daily weight gain，feed conversion rate and porcine serum antibody titer.However，compared BEI inactivated vaccine with the imported vaccine，there was statistically significant difference（P＜0.05）.The result indicated that the immune effect of inactivated Mycoplasma hyopneumoniae which was inactivated with BEI was better.

nactivate；binary ethylenimine；formaldehyde；Mycoplasma；immune efficacy

2014－08－25

A

1002－1280（2014）11－0019－05

S859.79＋7

王全杰，碩士，從事動物疫苗研究

丁國杰。E－mail：dingguojie1974＠126.com