徐引弟，張青嫻，李建林，張彬，王克領(lǐng)，朱文豪

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州450002）

PEDV、TGEV、RV多重RT－PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

徐引弟，張青嫻，李建林，張彬，王克領(lǐng)，朱文豪

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州450002）

為了快速準確診斷豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（RV）引起的豬腹瀉病，通過設(shè)計三對引物，建立了擴增PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR方法，用于臨床上大量腹瀉病料的鑒定。該方法特異敏感，能同時檢測PEDV、TGEV、RV，而對豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型病毒、乙型腦炎病毒、豬細小病毒等無擴增，檢測的抗原稀釋極限為107。用于35個豬場120份臨床樣品的檢測，PEDV陽性率占37.5%，TGEV陽性率占0.75%，RV陽性率占1.25%。PEDV陽性病料測序結(jié)果分析表明，與近幾年分離毒株親緣關(guān)系較近，與經(jīng)典毒株和疫苗株親緣關(guān)系較遠。結(jié)果表明建立的多重PCR方法特異性強、敏感度高，能用于臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬輪狀病毒；多重RT－PCR

2010年10月以來，我國大部分地區(qū)大部分豬場爆發(fā)一種以哺乳仔豬水樣腹瀉、嘔吐、高發(fā)病率和高死亡率為主要特征的豬病。此次疫情導(dǎo)致超過數(shù)百萬頭仔豬的死亡，一周齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病率幾乎100%，死亡率高達80%～100%，傳統(tǒng)的控制策略對當(dāng)前的腹瀉病控制效果不明顯，這次疫情持續(xù)時間長，給中國養(yǎng)豬戶及養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊［1－3］。經(jīng)過國內(nèi)外專家學(xué)者幾年不懈的努力，對引起此腹瀉病爆發(fā)的病原有了較為清晰的了解。引起此次嚴重腹瀉的病原主要是變異的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（porcine group A rotavirus，RV）等。其中PEDV是最為主要的病原［4－5］。由于PEDV、TGEV、RV三種病的臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)、病理變化等極其相似，臨床上很難區(qū)分，必須借助實驗室診斷，如病毒分離、免疫熒光、PCR等。PCR技術(shù)快速、特異、敏感，因此是快速診斷鑒別這三種疾病的首選。為了更加省時、省力、準確，在傳統(tǒng)的單一PCR的基礎(chǔ)上，本試驗建立了一種更加快速、特異、簡便的檢測PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR方法，并應(yīng)用于河南及周邊地區(qū)發(fā)生腹瀉的豬場的檢測，為腹瀉病的研究和防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗毒株及病料 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三聯(lián)弱毒疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)公司（中試）。豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型病毒（PCV2）、乙型腦炎病毒（JEV）、豬細小病毒（PPV）陽性病料由本室保存。腹瀉病料主要采自河南及周邊地區(qū)山西、河北等發(fā)生腹瀉豬場的腸道、糞便，即用、－20℃或－70℃保存。

1.2 工具酶及試劑 Total RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV、RNA酶抑制劑、pMD－18T、rTaq酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、DEPC滅菌水等均購自寶生物工程（大連）有限公司，Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、Taq PCR Master Mix購自上海生工工程公司。

1.3 疫苗及病料的處理 所有接觸RNA的耗材如剪刀、鑷子、注射器、EP管、吸頭、勻漿器等均經(jīng)0.1%DEPC水處理后滅菌烘干。疫苗按說明稀釋，反復(fù)凍融3次，取100 μL上清。對于腹瀉病豬腸道、糞便、CSFV、PRRSV、JEV等樣品，取約0.5 g，剪碎，加1 mL無菌PBS勻漿，－70℃反復(fù)凍融3次，8000 r／min離心5 min，取100 μL上清于1.5 mL EP管中備用。

1.4 總RNA、DNA的提取 取上述上清液100 μL，按照RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA，融于30 μL DEPC滅菌水。對PRV、PCV2、PPV陽性病料DNA提取參照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒說明，最后融于50 μL滅菌水。

1.5 引物設(shè)計 參考文獻［6－8］報道的方法以及Genbank中的序列，設(shè)計三對引物。PEDV引物序列上游P1：5’－TTTATTCTGTCACGCCAT－3’；下游P2：5’－AGATTTACAAACA CCTATGTTA－3’；擴增產(chǎn)物長度為199 bp。TGEV引物序列上游P3：5’－TATTTGTGGT TTTGGTTATAATGC－3’；下游P4：5’－GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA－3’；擴增產(chǎn)物長度為886 bp。RV引物序列上游P5：5’－GTATGGTATTGAATATACCAC－3’；下游P6：5’－GATCCTGTTGGCCATCC－3’；擴增產(chǎn)物長度為342 bp。引物由上海生工合成。

1.6 單一RT－PCR方法的建立 10 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×M－MLV buffer 2 μL、dNTP（10 mM／L）0.5 μL、分別加入P2（10 μM／L）1 μL、P4（10 μM／L）1 μL、P6（10 μM／L）1 μL、RNase酶抑制劑（40 U／μL）0.25 μL、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（5 U／μL）0.25 μL、疫苗總RNA 10倍倍比稀釋后取5 μL為模板，加DEPC滅菌水至10 μL，37℃水浴1 h，即用或－70℃?zhèn)溆谩?/p>

25 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP（10 mM／L）0.5 μL、P1、P2（10 μM／L）各0.5 μL、rTaq酶0.5 μL、cDNA 2 μL，加滅菌水至25 μL。PCR循環(huán)體系：95℃預(yù)變性5 min，進入循環(huán)，94℃30 s，53℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)后，72℃延伸5 min，結(jié)束后取10 μL用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳。TGEV、RV的反應(yīng)體系和循環(huán)體系同PEDV。對CSFV、PRRSV、JEV病料的RNA參照腹瀉病料進行反轉(zhuǎn)錄和PCR，對PRV、PCV2、PPV陽性病料DNA用PCR檢測。

1.7 多重RT－PCR方法的建立 參照單一PCR，在反轉(zhuǎn)錄體系中同時加入P2、P4、P6，模板以單一PCR結(jié)果均清晰為依據(jù)加入適合稀釋倍數(shù)，PCR反應(yīng)體系中同時加P1、P2、P3、P4、P5、P6三對引物進行PCR反應(yīng)。

1.8 RT－PCR的應(yīng)用 所建立的多重RT－PCR用于臨床發(fā)病豬120份病料的檢測。

1.9 陽性病料的序列分析 參照Genbank KF484734序列，針對PEDV S基因設(shè)計一對引物，上游引物P7：5’－CATACTAAAGTTGGTGGGAA－3’，下游引物P8：5’－CTGAGTCATGAACAGCCAAT－3’，擴增產(chǎn)物長度為894 bp。對PEDV擴增陽性的病料用P7、P8擴增，擴增產(chǎn)物連接pMD－18T載體，測序并分析。

2 結(jié)果

2.1 單一RT－PCR方法的建立 分別以P2、P4、P6反轉(zhuǎn)錄，分別以P1＋P2、P3＋P4、P5＋P6進行PCR，結(jié)果從疫苗中分別擴增出約199 bp、886 bp、342 bp片段?？俁NA稀釋至107倍，條帶仍清晰（圖1）。說明三種PCR敏感性高。三對引物擴增CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV陽性病料均為陰性，說明引物的特異性較好（圖2）。2.2 多重RT－PCR方法的建立 在反轉(zhuǎn)錄體系中同時加入P2、P4、P6，模板104倍數(shù)稀釋，PCR反應(yīng)體系中同時加三對引物。多重RT－PCR結(jié)果如圖3。

圖1 PEDV、TGEV、RV的RT－PCR敏感性檢測

圖2 PEDV、TGEV、RV的RT－PCR特異性檢測

圖3 PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR

2.3 多重RT－PCR的應(yīng)用 共采集來自35個豬場的120頭豬的樣品。結(jié)果PEDV陽性豬45份，占37.5%；TGEV陽性豬9頭，占0.75%；RV陽性豬15頭，占1.25%；其中PEDV、TGEV混合感染的有5份，占4.17%；PEDV、RV混合感染的有8份，占6.67%；沒有檢測出同時感染3種病毒的樣品。

2.4 陽性病料的序列分析 用引物P7、P8擴增陽性病料，擴增出預(yù)期大小片段（圖略）。序列命名CHHN2014。通過Blast比較，CHHN2014與CHXY－02株S基因序列（Genbank NO.KF484734）2012年河南毒株100%同源，與國內(nèi)其他分離株同源性均在99%以上，與美國2013年分離株同源性均在98.43%以上。與韓國2013年分離毒株同源性在98.43%以上。與經(jīng)典疫苗株CV777（AF353511）32個堿基變異，同源性為96.42%。序列分析結(jié)果表明與PEDV變異株同源性較高。系統(tǒng)進化樹分析（圖4）表明CHHN2014與國內(nèi)近2年分離毒株親緣關(guān)系最近，與越南2013年毒株（VN／KCHY－310113／2013／KhoaiChau／HungYen／Vietnam）、美國2013年毒株（USA／Minnesota52／2013）、韓國2013年毒株（KNU－1305）親緣關(guān)系較近，而與泰國2008年毒株（NPPED2008＿2）、韓國1997年毒株（KPEDV－9）以及疫苗株CV777親緣關(guān)系較遠。

圖4 PEDV陽性病料擴增的S基因的序列進化樹

3 討論

自2010年10月份以來，豬腹瀉病在我國呈現(xiàn)流行區(qū)域廣、流行強度大、危害十分嚴重。對很多地方的哺乳仔豬造成了毀滅性的打擊，給我國的生豬產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的疫苗防疫效果較差，返飼效果較差，藥物治療效果較差。2011年開始，一些報道存在PEDV變異毒株，這些變異毒株很可能是造成本次我國腹瀉流行的罪魁禍首［9－11］。

本文建立的PEDV、TGEV、RV的多重RT－PCR檢測方法，簡單特異，從樣品檢測的結(jié)果看，腹瀉豬場中PEDV的陽性率37.5%，比例較高，說明PEDV的感染率較高，危害十分嚴重，是本次疫情的主要病原。通過對PEDV陽性病料的測序及序列分析結(jié)果看，PEDV存在變異，與2008年以前的毒株以及疫苗株差異較大，而與近幾年國內(nèi)外毒株同源性較高［12－14］。除PEDV外，在腹瀉病料中，也檢測出傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒的感染，但比例稍低，并且有2種病毒混合感染的情況，進一步加重死亡的比例。

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（編輯：陳希）

Establishment and Application of Multiple RT－PCR Method for Diagnosis of PEDV，TGEV and RV Infection

XU Yin－di，ZHANG Qin－xian，LI Jian－lin，ZHANG Bin，WANG Ke－lin，ZHU Wen－h(huán)ao
（Institute for Animal Husbandry and Veterinary Research，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to establish a rapid and accurate method for diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV），porcine rotavirus（RV），three pairs of primers were designed and a multiple RT－PCR method to amplify PEDV，TGEV and RV was developed.The method is specific and sensitive and can be used simultaneously to detect PEDV，TGEV，RV，and can，tdetect CSFV，PRRSV，PRV，PCV2，JEV and PPV.The detection limit of antigen dilution was 107.For 120 clinical samples from 35 pig farms，PEDV positive rate with diarrhea accounted for 37.5%of diarrheal diseases material.TGEV positive rate was 0.75%and RV positive rate was 1.25%.Sequencing analysis of PEDV positive disease material shows that，it has closer relationship with isolates strains in recent years，than with classical strain and vaccine strain.The result showed that this multiple RT－PCR method was high sensitive，high specific and can be used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.

PEDV；TGEV；RV；multiple RT－PCR

2014－07－09

A

1002－1280（2014）11－0010－04

S852.65

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項目（2013ZZ30）

徐引弟，博士，副研究員，從事動物病原微生物方面研究。E－mail：445177674＠qq.com