王香玲，沈詩(shī)源，焦連國(guó)，張家旺，王芳芳，吳星亮，王排軍，王貴華?

（1.大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心，北京100095；2.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福州350014；3.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京100095）

豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王香玲1，沈詩(shī)源2，焦連國(guó)1，張家旺3，王芳芳1，吳星亮1，王排軍1，王貴華1?

（1.大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心，北京100095；2.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福州350014；3.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京100095）

根據(jù)豬偽狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守區(qū)段，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可區(qū)分豬偽狂犬病毒野毒株與基因缺失疫苗株的PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該P(yáng)CR方法可擴(kuò)增出388 bp的目的片段；對(duì)模板的最低檢測(cè)量為1.1 pg；與豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬細(xì)小病毒、豬支原體、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒無交叉反應(yīng)，具有高特異性。采用建立的PCR方法對(duì)2014年以來全國(guó)不同地區(qū)81個(gè)豬場(chǎng)421份疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PRV豬場(chǎng)平均陽性率為35.80%，樣品平均陽性率為25.42%。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于PRV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

豬偽狂犬病毒；PCR；野毒；疫苗毒

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種重要的傳染?。?－2］。到目前為止，該病的發(fā)生已給世界上許多國(guó)家和地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大的損失，我國(guó)已有20多個(gè)省市報(bào)道了該病的發(fā)生，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的威脅［1］。

快速的臨床診斷是防治豬偽狂犬病的一項(xiàng)重要措施。目前對(duì)PRV的各種診斷方法［3－7］均有其優(yōu)缺點(diǎn)，有的程序太復(fù)雜，有的耗時(shí)太長(zhǎng)，在發(fā)生急性動(dòng)物疫情或混合性感染、隱性感染時(shí)往往不能獲得滿意的檢測(cè)效果［1］。自21世紀(jì)以來，許多學(xué)者應(yīng)用PCR方法檢測(cè)偽狂犬病已取得很大的成果，他們根據(jù)PRV的gE序列設(shè)計(jì)了不同的引物，建立了檢測(cè)PRV的PCR檢測(cè)方法［8－9］。為了滿足豬場(chǎng)的需要以及達(dá)到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)準(zhǔn)確、迅速的要求，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)PRV的gE序列，經(jīng)過一系列比對(duì)，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性的引物，建立了一種PCR檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)采集的豬偽狂犬病病料進(jìn)行了檢測(cè)，以期為基層展開大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查與疫情檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒II型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬支原體（MHP）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉（PEDV）、乙腦（JEV）、豬傳染性胃腸炎（TGEV）等毒株均由大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心提供；豬瘟病毒（CSFV）為豬瘟兔化弱毒疫苗購(gòu)自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司；PRV疑似病料來自不同地區(qū)疑似豬群。1.1.2 主要試劑 LA Taq DNA聚合酶，蛋白酶K，MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；TransScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix，2×EasyTaq PCR SuperMix，購(gòu)自全式金生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù)GenBank已報(bào)道的豬偽狂犬病病毒，選擇gE基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)上、下游引物，上游引物PRV－F：5’－CGGCTTC?CACTCGCAGCTCTTCTC－3’位于gE序列的687～710 bp，下游引物PRV－R：5’－TGTGGGTCAT?CACGAGCACGTACAGC－3’位于gE序列的1050～1075 bp。引物預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為388 bp，由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 樣本DNA／RNA的提取以及cDNA的合成取200 μL 1.1.1中所述PRV、PCV2、PPV、MHP毒株，按照文獻(xiàn)［10］所述方法提取DNA，并保存于－20℃?zhèn)溆?。?00 μL 1.1.1中所述PRRSV、PEDV、JEV、TGEV、CSFV毒株，按照文獻(xiàn)［10］所述方法提取RNA。反轉(zhuǎn)錄按照MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄的cDNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PRV PCR檢測(cè)方法的建立及擴(kuò)增片段的鑒定利用已制備好的模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為25 μL：2×GC Buffer I：12.5 μL，dNTP：4 μL，PRV－F／PRV－R：0.5 μL，LA Taq酶：0.25 μL，滅菌水：5.25 μL，模板：2 μL。反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min；4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送英俊公司測(cè)序，將序列與GenBank中PRV的gE序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 利用上述建立的PCR方法，對(duì)PRV、PCV2、PPV、MHP、CSFV、PRRSV、JEV、PEDV、TGEV等參考毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 取PRV細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，提取病毒DNA，用紫外分光光度計(jì)定量后，將DNA做10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度取2 μL稀釋液作為模板，按照1.2.3體系及方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 利用已經(jīng)建立好的PCR反應(yīng)條件，取5份現(xiàn)地采集的PRV疑似病料，交由3名不同技術(shù)人員（甲、乙、丙）進(jìn)行檢測(cè)，不同的病料再重復(fù)2次（即進(jìn)行三批實(shí)驗(yàn)），從而驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.2.7 臨床應(yīng)用 利用上述建立的PCR方法，對(duì)來自不同地區(qū)的PRV疑似病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，分析2014年以來豬偽狂犬病的發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 PRV PCR檢測(cè)方法的建立及擴(kuò)增片段的鑒定以提取的病毒DNA為模板，以PRV－F和PRV－R一對(duì)引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到一條大約400 bp的目的條帶（圖1），條帶清晰，無雜帶拖帶現(xiàn)象。將擴(kuò)增的片段送Invitrogen（上海）公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果（圖2）進(jìn)行BLAST在線分析，結(jié)果表明該目的條帶為gE基因。

圖1 PRV的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn) 利用反應(yīng)條件優(yōu)化后的PCR方法，以陽性樣品和對(duì)照樣品的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅PRV陽性樣品能擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段，其他對(duì)照樣品均未有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖3）。

2.3 敏感性試驗(yàn) 將測(cè)定濃度后的病毒DNA（55 ng／μL）進(jìn)行10倍倍比稀釋，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在稀釋至10－5時(shí)仍可見特異性擴(kuò)增條帶（圖4），即在此PCR反應(yīng)中，模板的最低檢測(cè)量為1.1 pg。

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

圖3 PRV引物特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 3名技術(shù)人員分別對(duì)3批（每批5份）不同疑似病料進(jìn)行DNA提取以及PCR檢測(cè)，對(duì)每批病料，3名技術(shù)人員獲得的檢測(cè)結(jié)果相同（表1－表3），證明本方法的重復(fù)性很好。

表1 第一批實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 第二批實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 第三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用 采用本次試驗(yàn)建立的PCR方法，對(duì)2014年以來全國(guó)不同地區(qū)的81個(gè)豬場(chǎng)421份病料進(jìn)行檢測(cè)，表4結(jié)果顯示，有29個(gè)豬場(chǎng)107份樣品為PRV陽性，平均陽性率為35.80%和25.42%。

表4 2014年1－6月份PRV的陽性檢出率

3 討論

本研究成功建立了檢測(cè)PRV野毒的PCR方法，根據(jù)該方法能夠擴(kuò)增出一條特異性的片段，大小為388 bp，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線分析，證明擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)為PRVgE基因片段，可以繼續(xù)后面的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

目前，缺失gE基因的疫苗是預(yù)防PRV的首選疫苗，該基因已作為PCR診斷的最佳基因［11－12］被用于特異性地檢測(cè)PRV野毒感染的動(dòng)物，而根據(jù)該方法對(duì)PCV2、PPV、MHP、CSFV、PRRSV、JEV的檢測(cè)則均為陰性，說明本實(shí)驗(yàn)具有良好的特異性。本研究所建立的PCR方法在DNA模板量為1.1 pg時(shí)仍能擴(kuò)出目的片段，表明我們建立的PCR方法具有較高的敏感性。在重復(fù)性試驗(yàn)中，我們隨機(jī)選出3批，每批5份的PRV疑似病料，由3名技術(shù)人員同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果一致，表明所建立的方法具有很好地重復(fù)性。

我們利用該方法對(duì)全國(guó)不同地區(qū)的81個(gè)豬場(chǎng)421份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有29個(gè)豬場(chǎng)的107份樣品擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的條帶，陽性檢出率分別為35.80%和25.42%。而且，由表4我們可以發(fā)現(xiàn)，PRV的陽性率在今年2月份處于較高的水平，場(chǎng)家陽性率為68.75%，樣品陽性率為57.01%。

目前，隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬的不斷發(fā)展，PRV對(duì)豬群健康影響越來越大，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)PRV的PCR技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出現(xiàn)地病料的PRV野毒感染，對(duì)PRV的防制以及進(jìn)一步的分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯：李文平）

Establishment and Application of PCR for Detection of Pseudorabies Virus

WANG Xiang－ling1，SHEN Shi－yuan2，JIAO Lian－guo1，ZHANG Jia－wang3，WANG Fang－fang1，WU Xing－liang1，WANG Pai－jun1，WANG Gui－h(huán)ua1?
（1.Animal Medicine Research Center of Da Bei Nong Group，Beijing 100095，China；2.Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.，Ltd，F(xiàn)uzhou 350014，China；3.Da Bei Nong Group，Beijing 100095，China）

Based on the conserved region of gE gene，a pair of primers were designed，and a PCR assay which can distinguish wild strain and vaccine strains with gene deletion was established by improving condition.Meanwhile，the sensibility，specificity and repeatability of the assays were verified.The results demonstrated that the established PCR assay could amplify 388 bp target fragment，and could detect 1.1 pg DNA and no cross with porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，Mycoplasma hyopneumoniae，classical swine fever virus，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，swine Japanese encephalitis virus，porcine epidemic diarrhea virus.Using the established PCR method，421 suspected materials from 81 pig farms since 2014 were detected，the positive detection rate of pig farms and the materials were 35.80%and 25.42%，respectively.The PCR assay was sensitive，specific and accurate that could be used for massive samples detection and diagnosis of PRV infection.

pseudorabies virus；PCR；wild virus；vaccine virus

2014－07－29

A

1002－1280（2014）11－0005－05

S852.65＋9.1

王香玲，碩士，從事豬病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。

王貴華。E－mail：343621466＠qq.com