何宏月，朱穎軍，王 芳，林婉君

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜異位癥(Ems)是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織在子宮腔之外的部位浸潤生長所導(dǎo)致的疾病，其影響著6% ～10%的育齡期婦女，多種因素可促使EMs的發(fā)生［1］。miRNA是一類高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，其參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)節(jié)，miRNA與靶 mRNA的3'端的非編碼片段(3'UTR)配對，阻止該基因的翻譯過程或者促使其降解，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［2］。PTEN在 PI3K/Akt/PKB/cyclinD、FAK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR/STAT3等通路中有重要抑制作用，能促凋亡、抗增殖，而其缺失或突變則導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。文獻(xiàn)［3］發(fā)現(xiàn)，Ems中PTEN的表達(dá)降低。本研究觀察了Ems組織中微小RNA-21(miRNA-21)、PTEN蛋白的表達(dá)變化，并探討兩者在Ems發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年12月～2013年12月天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院診斷為Ems并接受腹腔鏡手術(shù)治療的Ems患者30例(觀察組)，年齡(42±3.4)歲。全部病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)?；颊咴陆?jīng)規(guī)律，無其他外科、內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受GnRH類似物、激素類藥物及抗生素治療，無圍絕經(jīng)期癥狀。術(shù)前行刮宮術(shù)收集在位內(nèi)膜，術(shù)中取材卵巢的異位子宮內(nèi)膜。另選同期因?qū)m頸原位癌行子宮切除術(shù)的患者30例作為對照組，年齡(41±4.3)歲。術(shù)后無菌條件下刮取子宮內(nèi)膜。兩組留取標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。所取組織置于Enpendorf管中，放入液氮罐，保存用于提取蛋白和RNA。

1.2 試劑與儀器 兔抗人PTEN單克隆抗體;鼠抗人GAPDH單克隆抗體;HRP標(biāo)記羊抗兔抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗;mirVana TM miRNA Isolation Kit;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit;Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit;DYY-7C型電泳儀;DU640紫外分光光度計(jì);Biometra PCR擴(kuò)增儀;ABI Prism?7500型RT-PCR儀;電泳槽、玻璃板、海綿及樣品梳;引物由Primer 5軟件設(shè)計(jì)，具體引物序列:miRNA-21:GGACTAGCTTATCAGACTG，CATCAGATGCGTTGCGTA;U6snRNA:ATTGGAACGATACAGAGAAGAT，GGAACGCTTCACGAATTT。

1.3 miRNA-21和PTEN蛋白的檢測 ①miRNA-21:采用 RT-PCR法。用 TRIzol法提取組織中總RNA，用分光光度計(jì)測定OD值及RNA濃度，將提取的1 μL RNA加到20 μL體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，之后在RT PCR儀器中進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn):95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，62 ℃、40 ～60 s，循環(huán)40次，行3次平行實(shí)驗(yàn)。采用相對定量的方法，以U6的表達(dá)為內(nèi)對照，依據(jù)公式ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，分別計(jì)算觀察組和對照組的ΔCt，目的基因的相對表達(dá)量為2－ΔΔCt，記錄3次實(shí)驗(yàn)的相對表達(dá)量，取其平均值。②PTEN蛋白:采用Western blotting法。提取組織中蛋白，等質(zhì)量上樣電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育，最后加入顯影液，進(jìn)行圖像分析。用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，將目的條帶與GAPDH的灰度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量，記錄3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較用t檢驗(yàn)及單因素方差分析;Pearson直線相關(guān)性檢驗(yàn)分析觀察組miRNA-21、PTEN蛋白的相關(guān)性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 兩組miRNA-21、PTEN蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與同組在位內(nèi)膜比較，﹟ P＜0.01

組別 n miRNA-21 PTEN 蛋白觀察組30 0.068 9±0.010 7 1.946 1±0.101 9 30異位內(nèi)膜 0.416 8±0.052 7△﹟ 1.151 4±0.046 5△﹟在位內(nèi)膜 0.241 4±0.033 3* 1.497 8±0.037 2△對照組

2.2 觀察組miRNA-21、PTEN蛋白表達(dá)的關(guān)系Pearson直線相關(guān)性檢驗(yàn)分析顯示，觀察組miRNA-21表達(dá)與PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.464，P＜0.01)。

3 討論

Ems是一種具有一定惡性行為的婦科良性疾病，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、黏附、浸潤性生長及血管生成是其發(fā)生的病理基礎(chǔ)。近年來，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)已經(jīng)成為增殖性病變分子研究的熱點(diǎn)，作為自然形成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，miRNAs通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)的穩(wěn)定性，在多種生命活動中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞生成、分化、凋亡、炎癥及免疫反應(yīng)等，可能成為發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素［4］。

miRNAs通過抑制其靶mRNAs的表達(dá)或促進(jìn)靶mRNAs的降解調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。miRNA的異常表達(dá)與許多人類的腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其中miRNA-21位于17q23.1，在人類腫瘤中起重要作用，在腫瘤中表達(dá)升高，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及增殖能力，包括宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮肌瘤、EMs相關(guān)的卵巢癌［5～11］。本研究顯示，觀察組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中miRNA-21表達(dá)均高于對照組，這與上述在其他疾病中研究結(jié)果一致。Meng等［12］在人肝癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可以通過調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)起到促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、浸潤的作用，PTEN是miRNA-21的直接作用靶點(diǎn)，PTEN mRNA的3'UTR區(qū)存在miRNA-21的直接結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-21通過與之結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［12～14］。研究表明，miRNAs通過調(diào)節(jié)其廣泛的靶基因改變子宮內(nèi)膜的生理及生物學(xué)特性，miRNA在異位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜間的表達(dá)有差異，這些差異表達(dá)的miRNA可能與Ems的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［15］。但其作用的精細(xì)過程并不清楚，因此獲取更多的miRNA信息對于研究是必須的?，F(xiàn)在的研究集中于三個(gè)方向:①在全基因組水平建立miRNA表達(dá)譜與編碼基因表達(dá)譜及其蛋白之間的聯(lián)系，揭示Ems發(fā)生的分子機(jī)理;②明確 Ems中miRNA的差異表達(dá)的構(gòu)成及其生物特性變化;③發(fā)展有效的技術(shù)來精密地調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，最終建立起新的治療方法。

抑癌基因PTEN又名MMAC1或TEP1，1997年分別由 Li等［16］、Li等［17］和 Steck 等［18］3 個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，PTEN基因定位于10號染色體q23.31區(qū)，全長200 kb，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框由1 209個(gè)核苷酸組成，并編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白。在Ems基因小鼠模型中，從Ems進(jìn)展為子宮內(nèi)膜樣癌依賴于克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因激活和第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物腫瘤抑制基因的失活［19］。PTEN蛋白同時(shí)具有脂質(zhì)和蛋白雙特異磷酸酶活性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因［20］。PTEN蛋白的脂質(zhì)磷酸酶活性可使細(xì)胞周期停滯在G1/S期，還可以通過影響PI3K活性而控制Akt磷酸化水平，并激活A(yù)kt下游信號蛋白成員，作用于細(xì)胞生理的多個(gè)方面，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移及分化等，從而促進(jìn)細(xì)胞增生、血管形成、抑制凋亡［21］。本研究顯示，觀察組 PTEN蛋白表達(dá)降低，提示PTEN蛋白可導(dǎo)致異位內(nèi)膜異常的增殖、黏附、遷移等，與Ems的發(fā)生密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組miRNA-21表達(dá)與PTEN基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，我們推測在Ems組織中高表達(dá)的miRNA-21可能通過抑制PTEN表達(dá)，調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)子宮內(nèi)膜在子宮腔以外的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移及血管形成等，參與Ems的分子發(fā)病機(jī)制，但其具體調(diào)控功能尚需進(jìn)一步研究。

隨著對于miRNA作用機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，miRNA很可能會成為疾病診斷的新生物學(xué)標(biāo)志物，或是作為藥物作用的靶點(diǎn)進(jìn)行新藥研發(fā)，為Ems治療提供新的手段。

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