洪衛(wèi)文，蘇國強，應紅安，林峰，梁衛(wèi)東

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺州 318020；2.廈門大學附屬第一醫(yī)院 普外科，福建廈門 361000；3.臺州市第一人民醫(yī)院 特需VIP病區(qū)，浙江 臺州 318020）

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）與腫瘤侵襲轉移的高度相關性已在一些研究中得到證實[1-2]。FAK在原發(fā)性大腸癌、肝癌組織中高表達可能促進腫瘤侵襲轉移，并有研究證實沉默FAK表達可以抑制乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞的增殖及轉移[3-5]。FAK沉默有望成為結直腸癌治療的新方法，而目前國內有關穩(wěn)定沉默FAK的結腸癌細胞模型鮮有報道。本研究應用已構建的FAK RNA干擾（RNA interference，RNAi)慢病毒載體，通過包裝293T細胞產生重組病毒，感染SW620結腸癌細胞，并使用新霉素G418篩選穩(wěn)定感染病毒的細胞株，以建立穩(wěn)定FAK沉默的結腸癌細胞株SW620模型。此方法將為進一步研究沉默FAK基因表達對人轉移大腸癌細胞的侵襲和轉移的裸鼠體內實驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒表達載體pLentilox3.7、293T細胞、大腸桿菌DH5α均由廈門大學李博安教授惠贈。慢病毒包裝系統(tǒng)由pLentilox3.7、PHR、VSVG質粒組成。

1.2 主要的儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma），倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、照相顯微鏡（日本Olympus），培養(yǎng)板（美國Costar），等。試劑：質粒小抽提取試劑盒（美國Qiangen），DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、新生小牛血清、DMEM、G418、NEAA、RMPI 1640（美國Gibco），氨芐青霉素、TEMED（美國Sigma），TurboFect（美國Fermentas），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美國Millipore），24孔板、細胞計數板（美國Costar），Tris（美國Boehringer Mannheim），SDS（中國華美生物），羊抗鼠二抗（中國博士德）。

1.3 方法

1.3.1 重組RNAi質粒的擴增與提?。合駾H5α感受態(tài)細菌100μL中加入構建好的重組RNAi質粒，冰浴30 min；42 ℃水浴鍋中熱休克90 s，冰浴2 min，然后鋪于含氨芐霉素（30μg/mL）的瓊脂平板表面，挑單個菌落，孵育12～16 h，按照試劑盒操作說明書提取純化質粒。

1.3.2 重組FAK RNAi質粒的酶切鑒定將重組質粒和空載體同時雙酶切：產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，分析酶切產物，進行酶切鑒定。①干擾質粒酶和對照空載體酶切體系：XbaI 1.0μL，NotI 1.0μL，10×M Buffer 2.0μL，質粒＜1μg，無菌水補足至20.0μL，反應條件為37 ℃水浴鍋中酶切2～3 h。②酶切產物電泳：預期結果為重組質粒組504 bp和7146 bp；空載體組為449 bp和7201 bp。1.3.3 慢病毒包裝及滴度測定：采用改良的陽離子聚合物轉染法：①轉染前1 d將293FT細胞加入DMEM完全培養(yǎng)基，制成細胞懸液。②依次加入A體系：plasmid（pLL3.7 20μg，PHR 15μg，VSVG 6μg）10μL；B體系：Fermentas TurboFect轉染試劑10 μL。③收集細胞上清加入新鮮的培養(yǎng)基，直到病毒完全被溶解。PBS將DAPI 1000倍稀釋，在流式細胞儀下檢測GFP表達頻率。病毒滴度（IU/mL）=GFP陽性細胞數占總細胞數的百分比÷5×1.5×105×103。

1.3.4 腫瘤細胞培養(yǎng)、分組及重組慢病毒質粒感染腫瘤細胞：SW620細胞以1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，20～24 h至細胞融合度達90%。實驗分三組：實驗組（轉染慢病毒質粒的pLL3.7 FAK的SW620細胞），陰性對照組（轉染陰性對照慢病毒質粒pLL3.7的SW620細胞），未處理組（未轉染質粒的SW620細胞）。在最佳病毒感染指數（multiplicity of infection，MOI）下感染對數生長期SW620細胞，感染慢病毒后，隨MOI增加，感染細胞數逐漸增加，本實驗設定MOI=20，并加入1000×Polybrene 10μL，48 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3.5 篩選穩(wěn)定轉染重組慢病毒質粒的SW620細胞株：加入新霉素G418，使?jié)舛冗_到800μg/mL，取14 d內完全殺死細胞的最低濃度作為篩選濃度，本實驗采用700μg/mL進行前2周的篩選，2周后以50μg/mL維持篩選。

1.3.6 采用RT-PCR法檢測干擾前后FAK的mRNA表達：①提取細胞總RNA；②RT反應：總RNA 1μg，RT Enzyne MIX 1μL，Primer MIX 1μL，5×RT buffer 4μL，ddH2O 20μL?；靹蚝?，65 ℃ 5min；37 ℃ 20 min；98 ℃ 5 min。③PCR反應：FAK正義引物為5’-ACATTATTGGCCACTGTGGATGAG-3’，反義引物為5’-GGCCAGTTTCATCTTGTTGATGAG-3’，擴增片段為125 bp；內參β-actin 正義引物為5’-GATGCAG AAGGAGATCACTG-3’，反義引物為5’-GGGTGTAACGCAA CTAAGTC-3’，擴增片段為222 bp。先94 ℃變性3 min，隨后94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，共擴增35個循環(huán)，最后繼續(xù)72 ℃延伸5 min，4 ℃放置，凝膠電泳并照相。

1.3.7 采用Western blot法檢測干擾前后FAK的蛋白表達：①細胞總蛋白提取。②考馬斯亮藍染色法測定總蛋白濃度：樣品的蛋白濃度=（樣品的OD值-空白組的OD值）/（標準品的OD值-空白組的OD值）×5。③蛋白變性：100 ℃變性8 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂躓estern blot法的具體步驟:按照說明書首先SDS-PAGE垂直電泳，然后蛋白質轉膜，最后行抗原-抗體反應及化學發(fā)光顯色。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數據用±s表示，樣本均數間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒包裝及滴度測定 熒光倒置顯微鏡觀察可見各組均表達大量的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），測定滴度為2.89×107 TU/mL，表明慢病毒包裝成功（見圖1）。

圖1 轉染293T細胞48 h熒光圖（×100）

2.2 各組SW620細胞轉染慢病毒后熒光圖 相應的慢病毒轉染入實驗組與陰性對照組，各組均表達較多綠色熒光信號，表明慢病毒轉染成功（見圖2）。

圖2 轉染細胞表達綠色熒光圖（×100）

2.3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細胞株的建立 shRNA重組慢病毒感染SW620細胞后使用濃度800μg/mL G418篩選14 d后實驗組及陰性對照組細胞均恢復生長，形態(tài)轉好，熒光較前亮，同時熒光率高（見圖 3）。

圖3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細胞株篩選后熒光圖（×100）

2.4 FAK RNAi載體的干擾效率檢測

2.4.1 RT-PCR檢測FAK mRNA表達：以β-actin作為內參照，各組細胞均能擴增出約125 bp的FAK基因片段，用Quantity-One定量分析軟件進行條帶灰度分析，測定出各樣本FAK mRNA的相對表達量，結果顯示各組FAK mRNA表達分別為：實驗組為1.016±0.047、陰性對照組為3.971±0.127、未處理組為4.210±0.169，實驗組中FAK mRNA表達較陰性對照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 RT-PCR實驗結果

2.4.2 Western blot法檢測FAK蛋白表達：以βactin作為內參照，用Quantity-One定量分析軟件進行條帶灰度分析，各組FAK蛋白表達分別為：實驗組為0.374±0.022、陰性對照組為3.216±0.101、未處理組為2.926±0.142，實驗組中FAK蛋白表達較陰性對照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blot法檢測結果

3 討論

大腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，致死率高并容易發(fā)生轉移，我國近年大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，遠處轉移是大腸癌患者的主要死因。FAK在整合素介導的細胞遷移、細胞周期和細胞存活等功能中起關鍵作用[6-7]，抑制FAK的表達可有效地降低腫瘤細胞的黏附和侵襲[8-10]。FAK有望成為新的腫瘤標志物、腫瘤治療的重要靶點，為惡性腫瘤的綜合診治提供新的思路。

RNAi具有很強的抑制目的基因的作用，較反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更強，被認為是繼PCR后又一劃時代的基因工程方法[11-13]。慢病毒載體可感染非分裂細胞、目的基因長期表達、免疫反應小，逐漸成為理想的基因轉移載體[14]。本實驗利用RNAi技術，使用慢病毒載體pLL3.7包裝成慢病毒，并用改良的病毒感染方法成功感染SW620結腸癌細胞，通過慢病毒載體自帶的新霉素抗性基因篩選單克隆細胞，并擴增培養(yǎng)，從而構建出穩(wěn)定沉默FAK的結腸癌的細胞模型，是研究FAK在結腸癌細胞侵襲轉移等作用機制中不可或缺的一步。為此，本研究就構建FAK的結腸癌細胞株進行探討性研究，首先在選用結腸癌細胞株上，采用的是SW620，此細胞容易培養(yǎng)、生長速度適中，常規(guī)培養(yǎng)條件下能穩(wěn)定傳代，一般12～24 h分盤一次，另外SW620是從結腸癌患者轉移淋巴結中獲取并建立的，惡性程度較高，容易發(fā)生轉移，是研究FAK在結腸癌轉移中的合適的實驗對象；另外采用的慢病毒載體pLL3.7為病毒載體，帶有GFP及新霉素抗性基因，可以在體外甚至體內示蹤細胞，方便細胞感染后篩選目的細胞，并且具有FAK基因沉默效率高、穩(wěn)定等優(yōu)點，通過Western blot法檢測FAK蛋白表達下降90%以上，感染細胞通過多次的傳代后FAK表達始終處于低水平，有效減少后期實驗誤差；病毒感染細胞是通過多次預實驗，采用不同藥物及劑量對照，最終選定Fermentas TurboFect轉染試劑及最合適的劑量成功感染SW620細胞，通過觀察發(fā)現感染率極高，感染后細胞生長無明顯抑制。在細胞篩選過程中利用質粒中的neo抗性基因，使用不同劑量G418階梯篩選預實驗后，采用最合適的劑量對感染后細胞進行篩選，并選取熒光表達高的單克隆細胞株進行培養(yǎng)擴增，目的細胞能穩(wěn)定傳代擴增，從而最終構建了穩(wěn)定沉默FAK的結腸癌細胞株；本細胞株的構建為下一步體外研究FAK基因在結腸癌細胞中的作用及相關機制提供前提，并為進一步將FAK沉默的腫瘤細胞移植至裸鼠體內的實驗研究奠定基礎。

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