林發(fā)明，金建華，薛靜，包其郁，劉朝兵，倪麗艷

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.河北石家莊第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050011；4.溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)信息研究所/浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；5.河北省眼科醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河北 邢臺(tái) 054001）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。喉癌的發(fā)病原因尚未明確，目前認(rèn)為是由以環(huán)境和遺傳因素為主的多因素綜合作用的結(jié)果，從腫瘤分子遺傳學(xué)角度研究與喉癌相關(guān)的遺傳因素，并通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析，篩選可能的易感基因，對(duì)揭示喉癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。CYP1B1能將多環(huán)芳香烴、雜環(huán)胺等多種前致癌物的代謝激活[2-3]，形成具有活性的細(xì)胞毒性物質(zhì)和DNA中間體，是腫瘤易感性的可能發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)機(jī)制[4-5]?，F(xiàn)已證實(shí)至少有50個(gè)能夠影響CYP1B1蛋白編碼的多態(tài)性位點(diǎn)，而在這其中142C/G、355G/T（CYP1B1*2），4326C/G（CYP1B1*3），4390 A/G（CYP1B1*4）四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)能夠引起相應(yīng)氨基酸的改變影響代謝酶對(duì)致癌物的代謝活性[6-7]。本研究通過(guò)病例對(duì)照研究方法來(lái)分析CYP1B1三個(gè)重要多態(tài)位點(diǎn)CYP1B1*2 142C/G、355 G/T，CYP1B1*3 4326C/G遺傳變異與喉癌易感性的關(guān)系，為喉癌高危人群的預(yù)防及早期診斷等提供重要線索。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2007年8月至2011年8月河北石家莊第一醫(yī)院以及河北省眼科醫(yī)院診斷為喉癌的200例喉癌患者作為病例組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)灶經(jīng)組織病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌；②取血標(biāo)本前未經(jīng)放化療；③血標(biāo)本保存完整；④臨床資料齊全；⑤均為漢族人群且相互之間無(wú)血緣關(guān)系。對(duì)照組選取同一時(shí)期經(jīng)上述兩家醫(yī)院體檢中心體檢為健康人群200例，入選標(biāo)準(zhǔn)除包含上述②～⑤條標(biāo)準(zhǔn)外還需含：①經(jīng)體檢無(wú)腫瘤及腫瘤病史；②無(wú)家族腫瘤遺傳史；③無(wú)職業(yè)性接觸放射線物質(zhì)、有毒氣體等致癌物史。對(duì)照組按性別和年齡與患者頻數(shù)配對(duì)，兩組在年齡、性別方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P=0.150、P=0.792）。本試驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論通過(guò)。受試者本人均知情同意。

1.2方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)：多重PCR引物及延伸引物由SEQUENOM公司Assay Design 3.1程序設(shè)計(jì)，由北京擎科公司合成PCR引物及延伸引物序列（見表1）。1.2.2 基因組DNA提?。撼槿∈茉囌咧忪o脈血標(biāo)本3～4 mL加入EDTA抗凝管中，于-70 ℃低溫保存。使用AxyPrep全血基因組DNA試劑盒（AxyPrep愛思進(jìn)科學(xué)有限公司）提取DNA。

1.2.3 基因擴(kuò)增與分型：①儀器與試劑：Applied Biosystems公司的GeneAMP PCR System 9700；MassARRAY Compact System；②PCR及SNP分型：通過(guò)多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)所選的SNP位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增（反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，經(jīng)95℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s 45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min）。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SAP酶純化并加入ddNTP，通過(guò)延伸引物來(lái)實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增（反應(yīng)條件：①94 ℃預(yù)變性30 s，②94 ℃變性5 s，③52 ℃退火5 s，④80 ℃延伸5 s，③、④循環(huán)5次，然后②～④循環(huán)40次，⑤72 ℃延伸3 min）。延伸完畢后，產(chǎn)物通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）基因分型技術(shù)，進(jìn)行SNP分型。

表1 各單核苷酸引物及延伸引物

1.3 煙酒量評(píng)估 吸煙用吸煙指數(shù)（smoking index，SI。SI=每天吸煙支數(shù)/20×吸煙年數(shù)）來(lái)評(píng)估，年包在20以下（含20）為輕吸煙者，大于20為重吸煙者[8]。同樣飲酒按飲酒指數(shù)（drinking index，DI。DI=每天飲酒毫升×飲酒年數(shù)）來(lái)評(píng)估，分為少量飲酒者（DI≤60）和大量飲酒者（DI＞60）[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Hard-weinberg平衡檢驗(yàn)病例組及對(duì)照組CYP1B1基因型和等位基因頻率分布是否具有群體代表性。Haploview 3.2軟件（http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/）進(jìn)行單倍體分析：包括單倍體構(gòu)建，連鎖不平衡性的評(píng)估。采用四格表x2檢驗(yàn)檢驗(yàn)基因型和等位基因頻率之間的差異，分別用logistic回歸和非條件logistic回歸模型計(jì)算各基因型與喉癌風(fēng)險(xiǎn)的OR值、95%可信區(qū)間（95%CI），以及調(diào)整后值。非條件logistic回歸模型計(jì)算CYP1B1個(gè)位點(diǎn)之間的聯(lián)合作用以及與吸煙、飲酒及聯(lián)合作用。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料特征 病例組與對(duì)照組危險(xiǎn)因素的分布情況見表2。在病例組中男性患者（約占96%）明顯較女性多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。大部分喉癌患者具有長(zhǎng)期的吸煙、飲酒史：病例組中吸煙人數(shù)所占比例（為86.0%）比對(duì)照組（為65.6%）明顯要高（P＜0.001），重吸煙組人群喉癌風(fēng)險(xiǎn)顯著增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR:5.065，95%CI:3.386～7.575，P＜0.001），輕吸煙組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR:1.452，95%CI:0.921～2.288，P=0.108）；同樣，在病例組中飲酒人數(shù)（為67.0%）要高于對(duì)照組（為48.5%）（P＜0.001），并且在大量飲酒組中喉癌風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR:3.789，95%CI: 2.674～5.370，P＜0.001），而在少量飲酒組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR:0.926，95%CI:0.617～1.390，P=0.711）。

表2 煙酒等危險(xiǎn)因素在病例組與對(duì)照組中的分布（n=200，±s，n/%）

表2 煙酒等危險(xiǎn)因素在病例組與對(duì)照組中的分布（n=200，±s，n/%）

注：Ref.：參考類別

變量年齡（歲）性別病例組37～92（63.13±10.238）對(duì)照組44～89（63.20±9.330）OR（95%CI）P 0.150 0.792男 女192/0.96 8/0.04 193/0.96 7/0.04吸煙狀態(tài)非吸煙吸煙（SI）≤20＞20飲酒狀態(tài)非飲酒飲酒（DI）≤60＞60 28/14.0 172/86.0 26/0.27 146/0.73 66/33.0 134/67.0 33/16.5 101/50.5 69/34.4 131/65.6 67/67.8 64/32.2 103/51.6 97/48.5 55/27.5 42/21.0 1（Ref.）1.452（0.921～2.288）5.065（3.386～7.575）1（Ref.）0.926（0.617～1.390）3.789（2.674～5.370）＜0.001 0.108＜0.001＜0.001 0.711＜0.001

2.2 等位基因和基因型的分布 三個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率見表3。所有樣本均符合Hardy-weinberg平衡（P＜0.05），所選樣本具有群體代表性。在病例組和對(duì)照組中等位基因CYP1B1*2 142G、355T及CYP1B1*3 4326G比率分別為17.8%、36.5%、8.8%和20.0%、30.2%、11.8%。CYP1B1*2 355G/T和CYP1B1*3 4326C/G基因型在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P＜0.001，P=0.007），二者雜合子基因型與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（頻率分別為74.0%、54.5%，P＜0.001；22.5%、13.5%，P=0.004）。

2.3 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與喉癌的關(guān)系 攜帶CYP1B1*2 355G/T突變型等位基因T的病例組患病風(fēng)險(xiǎn)高于對(duì)照組（crude OR=2.022，95%CI:1.376～2.971，P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)年齡、性別、吸煙及飲酒等因素校正后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Adjusted OR=2.281，95%CI:1.142～3.516，P＜0.001）。

與CYP1B1*2 355G/T相反，攜帶CYP1B1*3 4326C/G突變等位基因G的病例組患病風(fēng)險(xiǎn)要低于對(duì)照組（crude OR=0.605，95%CI: 0.410～0.894，P=0.012）。經(jīng)年齡、性別、吸煙及飲酒等因素校正后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Adjusted OR=0.571，95%CI:0.370～0.882，P=0.011.）。

CYP1B1*2 142C/G各基因型在病例組與對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.265），與喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性。

2.4 基因聯(lián)合作用與喉癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 基因聯(lián)合作用對(duì)喉癌易感性的影響見表4。在可能的8種單倍體構(gòu)型中構(gòu)建出7種單倍體型，其中只有兩種與喉癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。最常見的單倍體型是C142G355C4326在病例組與對(duì)照組中分別占60.8%、64.7%。C142T355C4326相對(duì)C142G355C4326單倍體型患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（Adjusted OR=3.180，95%CI:1.760～5.746，P＜0.001）。

表3 多態(tài)性基因型在病例對(duì)照組中的分布（n=200，n/%）

表4 單倍體型組合在病例組和對(duì)照組中的分布（n=400，n/%）

2.5 基因和環(huán)境因素的聯(lián)合作用與喉癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 三個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)分別與吸煙飲酒的聯(lián)合作用對(duì)喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)的影響見表5。在非吸煙組中，攜帶CYP1B1*2 355G/T基因型GT+TT患病風(fēng)險(xiǎn)度OR為2.080（95%CI: 0.742～5.830）；在吸煙組中其相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)度OR為6.322（95%CI: 2.541～15.725，P＜0.001），與吸煙和基因單因素下分別對(duì)喉癌危險(xiǎn)度相乘OR值近似（3.046×2.080=6.336）。在非飲酒組中，攜帶CYP1B1*2 355G/T基因型GT+TT患病風(fēng)險(xiǎn)度OR為2.094（95%CI: 1.056～4.135）；在飲酒組中其相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)度OR為3.997（95%CI: 2.098～7.613，P＜0.001），與飲酒和基因單因素下分別對(duì)喉癌危險(xiǎn)度相乘OR值近似（1.931×2.094=4.044）。以上數(shù)據(jù)均未顯示CYP1B1*2 355G/T基因多態(tài)性和吸煙、飲酒與喉癌對(duì)患病風(fēng)險(xiǎn)的增加不表現(xiàn)相互協(xié)同作用。同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)CYP1B1*2 142C/G、CYP1B1*3 4326C/G多態(tài)性基因位點(diǎn)與吸煙、飲酒的聯(lián)合效應(yīng)在喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)中的作用（數(shù)據(jù)未完全列出）。

表5 基因與煙酒的相互作用對(duì)喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)的影響（n=200，n/%）

3 討論

本次針對(duì)中國(guó)北方人群的病例對(duì)照研究顯示CYP1B1*2 355G/T、CYP1B1*2 4326C/G基因的多態(tài)性與喉癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有密切關(guān)系。CYP1B1*2 355G/T突變型等位基因T與喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，CYP1B1*3 4326C/G突變型等位基因G能夠降低喉癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，具有一定的保護(hù)效應(yīng)。

CYP1B1*2 355G/T多態(tài)性位點(diǎn)位于染色體2p21-22第二個(gè)外顯子上，其等位基因的變異能夠引起相應(yīng)的氨基酸Ala向Ser改變。Singh等[10]研究表明CYP1B1*2 C355T變異與頭頸部腫瘤相關(guān)，其突變型基因型能夠增加頭頸部腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。Jawarowska等[11]也發(fā)現(xiàn)CYP1B1*2 355T等位基因能夠增加喉癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。Shah等[12]指出CYP1B1*2 355T在肺鱗狀細(xì)胞癌患者中高表達(dá)，對(duì)肺癌的易感性增加具有重要意義。本次研究同樣發(fā)現(xiàn)攜帶CYP1B1*2 355T突變體受試者患病風(fēng)險(xiǎn)較野生型明顯增加。所有以上資料顯示CYP1B1*2 G355T是喉癌的危險(xiǎn)基因，其突變體基因型能夠增加喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)。但是其作用機(jī)制尚不十分明確。

CYP1B1*3 4326C/G多態(tài)性位點(diǎn)位于染色體2p21-22第三個(gè)外顯子上，其等位基因的變異能夠引起相應(yīng)的氨基酸Leu向Val改變。Church等[13]研究表明攜帶突變型等位基因的吸煙者顯著增加患肺癌風(fēng)險(xiǎn)，但該基因位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系尚不明確，Tai等[8]認(rèn)為其多態(tài)性與下咽癌、喉癌易感性無(wú)相關(guān)性，但是Trubicka等[14]研究數(shù)據(jù)顯示在直腸癌患者中攜帶突變體G的基因型的表達(dá)水平明顯較正常對(duì)照組低，表明突變型等位基因的存在可能降低直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)易感人群具有保護(hù)效應(yīng)。這也與本研究結(jié)果相一致：CYP1B1*3 4326C/G雜合子基因型在病例組中表達(dá)顯著降低，提示該突變位點(diǎn)的等位基因發(fā)生C→G突變時(shí)對(duì)降低喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)具有保護(hù)作用。這種結(jié)果的差異可能與不同種族之間的基因構(gòu)成或者有其他混雜因素如其他多態(tài)性基因位點(diǎn)的影響造成，還有可能與統(tǒng)計(jì)樣本容量相關(guān)。

同時(shí)我們沒有發(fā)現(xiàn)CYP1B1*2 142C/G多態(tài)性位點(diǎn)與喉癌具有相關(guān)性，在其他腫瘤如卵巢癌的研究[15]中也未發(fā)現(xiàn)具有相關(guān)性，提示雖然CYP1B1*2 142C/G位點(diǎn)的變異能夠引起氨基酸Arg轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly，但是并不改變相應(yīng)酶的活性。

單倍體分析表明，C142G355C4326是最常見的單倍體構(gòu)型，這在其他研究資料中鮮見報(bào)道。單基因分析顯示CYP1B1*2 G355T突變型基因是喉癌的危險(xiǎn)基因，CYP1B1*3 4326C/G突變型基因是喉癌的保護(hù)基因，與此同時(shí)可以假設(shè)CYP1B1*3 4326C/G野生型基因位點(diǎn)為相對(duì)危險(xiǎn)基因。本次聯(lián)合基因的分析發(fā)現(xiàn)C142T355C4326單倍體型較其他單倍體構(gòu)型患喉癌風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，且其風(fēng)險(xiǎn)度亦比單基因分析時(shí)高，C142G355G4326單倍體型與常見單倍體型C142G355C4326相比其患喉癌發(fā)現(xiàn)有所降低。表明隨著危險(xiǎn)及相對(duì)危險(xiǎn)位點(diǎn)的增多其患喉癌危險(xiǎn)度也不斷增加，反之隨著保護(hù)及相對(duì)保護(hù)位點(diǎn)的增多其患喉癌危險(xiǎn)度逐漸降低。此次分析也進(jìn)一步證實(shí)CYP1B1*2 355T是喉癌患病的危險(xiǎn)等位基因，CYP1B1*3 4326G是喉癌患病的保護(hù)等位基因。

喉癌流行病學(xué)資料表明環(huán)境因素是腫瘤的重要病因，其中煙酒尤為重要。煙草中的前致癌物環(huán)芳烴、雜環(huán)胺、芳香胺和硝基多環(huán)烴以及酒精代謝產(chǎn)物乙醛經(jīng)CYP1B1代謝酶活化形成致癌物質(zhì)[16]，激活癌基因。我們研究結(jié)果顯示吸煙、飲酒尤其是重度吸煙、重度飲酒者患喉癌風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)煙酒是喉癌的危險(xiǎn)因素。但是在對(duì)基因-環(huán)境聯(lián)合因素與喉癌風(fēng)險(xiǎn)度分析中，并沒有發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用對(duì)喉癌風(fēng)險(xiǎn)度的增加。Soucek等[17]也未發(fā)現(xiàn)煙草與基因?qū)︻^頸部腫瘤有相互協(xié)同效應(yīng)。以上分析及資料顯示，煙酒以及CYP1B1*2 355G/T，CYP1B1*3 4326C/G多態(tài)性基因位點(diǎn)與喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但是聯(lián)合研究環(huán)境-基因因素對(duì)喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)的影響時(shí)，二者間不表現(xiàn)相互協(xié)同效應(yīng)，表明二者是喉癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示煙酒并不影響上述多態(tài)性基因位點(diǎn)的改變，二者之間不存在協(xié)同效應(yīng)[18]。

總之，本次研究表明CYP1B1基因的多態(tài)性與喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。單基因及多基因聯(lián)合分析進(jìn)一步證實(shí)CYP1B1*2 355G/T突變型基因是喉癌的風(fēng)險(xiǎn)基因，CYP1B1*3 C355G突變型基因是喉癌的保護(hù)基因，聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)基因越多患癌風(fēng)險(xiǎn)越大。環(huán)境因素（煙酒）在喉癌的發(fā)生中扮演著重要作用，煙酒接觸越多危害越大，環(huán)境-基因之間的聯(lián)合作用并不增加喉癌患病風(fēng)險(xiǎn)。

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